RT－PCR技术及RNA提取策略-2
一般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲醛变性电泳（又不是做northern，实在没有必要）。电泳槽注意一定不要用DEPC处理，一定要保证电泳体系中有少量的RNAase存在。分别在加样孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁边加入DNA
marker。1%琼脂糖凝胶，10V/cm的电压，电泳10min成像一次，看电泳情况，如果28s和18s还没拉开，继续电泳10min成像，如果任没有拉开再次电泳5min。如果还没有分开多半28s已经遭到破坏，不可能看到典型的3条带了。
好的RNA的特征：
A、RNA应该呈现出3条rRNA带。分别是5，18，28SrRNA的带。5s最好是要可见，除非抽提步骤中故意将其破坏
B、28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例关系均提示RNA有一定程度的破坏。
C、不能有多的带出现。出现多的带有两个可能，一是DNA污染带，二是rRNA破坏断裂带。D、rRNA之间可以看到很淡的，雾蒙蒙的mRNA拖带。E、琼脂糖凝胶被RNAase处理后电泳带基本消失，没有明显的，边缘清晰的带残留（不用说这些就是明显的DAN污染，而且是很大量的DNA污染）
如何用RNAase处理凝胶呢，为何要处理??
DNA是不会被RNAase破坏的，所以我们发现凝胶有可疑的带需要鉴定其到底是RNA还是DNA，如果是DNA就有比较大的问题了，如果是RNA到不用过份担心，因为只是提示有rRNA断裂而已。我们可以在RNA电泳完成后，把胶用薄膜手套包好（RNase的良好来源），放置5－10h后再次成像。如果前面起初的带减弱并模糊了说明是RNA被降解，如果出现某个带或者拖影一直不见模糊，那么DNA污染的可能性就大了（由于RNA被降解，有时胶放置一阵后反而更清晰了。）注意RNA电泳加DNA
marker是很有必要的（虽然很多白痴说不需要，那是因为没有意识到具体DNA marker的作用）。DNA
marker加进去后，一来可以指示RNA电泳中可疑带的位置，方便和在胶被放置后成像的结果进行比较。注意比如28S在某个位置，有时候，胶被放置后
28S降解带会前后移动，不一定就在最初的位置形成一团降解后图象。其次DNA
marker有显示琼脂糖凝胶的功能状态的作用。EB等染色剂会挥发造成成像没有结果，DNA在胶中也会轻微弥散，此时如果胶放置后发现上面空空的，没有带出现，不要太高兴，不一定就是RNA在胶上降解完全了。事实上有可能是EB挥发引起胶不显色的结果，尤其有些人把胶一直泡在buffer中的情况。此外发现带型开始模糊也不一定就是RNA降解的结果，也可能是核酸都在弥散开。所以DNA
marker是非常重要的。
第二部分RT-PCR
一步法RT-PCR试剂盒子选择指南
RT-PCR试剂盒最好的有Qiagen，Invitrogen，Stratagene三个品牌。但是价格都比较昂贵，不是首选。其中 Promega是国内的首选，质量很好，价格合理，性价比最高的，投入和产出比最让人放心的产品。
Promega Access RT PCR试剂盒介绍： 使用的是1.AMV Reverse
Transcriptase（成功的RT必须考虑消除RNA中的多数次级结构。为次，合成cDNA的第1条链最好在较高的温度下进行。MmlV反转录酶能采用的最高温度是42摄氏度左右，AMV的活力在Access
RT-PCR系统中可以达到48摄氏度（但是实际上大多都是45摄氏度完成RT）。因此，使用AMV反转录酶，可以消除RNA次级结构的负面影响）2.Tfl
DNA Polymerase
这个是promega比较出名的Taq酶，性价比虽然不如takara，但是也不失为一种PCR利器。3.mRNA模板的量在1-100ng的范围内注意是mRNA的量哟。建议加1μg总RNA。4.不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液时活力有很大提高。
5.AccessQuick™ RT-PCR System 就是预装的Acess RT PCR
system，由于镁离子已经加到反应体系中，所以使用自主性稍为受限，但是更方便些，适合不太难的RT过程。价格稍为便宜些。
性价比比较高，推荐品种。Takara one step RNA PCR kit 使用的是1.AMV everse Transcriptase
可惜takara在酶制作方面主要强在PCR酶类，其他酶的制备不是很强。这也是该试剂盒不如promega的原因。2.AMV－optimized
Taq Takara的PCR酶制作功力实在不错。3.总RNA少于1μg
建议不要少加，因为该试剂盒的RT能力实在不让人彻底放心。但是多加模板会造成DNA模板污染加重。价格比较低廉，性价比个人认为不及Promega试剂盒。Takara
mRNA selective PCR kit 运用了特殊的机理来选择性的扩增cDNA。似乎说是mRNA
selective是不对的，其他RNA也是可以扩增的，关键是RT的选择啊。增污染DNA模板的。本来这个技术理论上是非常诱人的，可是考虑
takara的功力还是劝大家慎用。
