蛋白质组学实验技术大全
每一个领域的发展都是基于技术的进步和革新，蛋白质组学亦然。蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。在开始实验之前，先看看这篇技术简介吧。
一 蛋白质与DNA相互作用
在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。随着重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性的。为此需要：1. 鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；2. 分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子。这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。研究DNA-蛋白质相互作用主要包括以下实验方法：
1 凝胶迁移实验（EMSA）
EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
在此基础上又延伸出了DNA竞争实验（DNA competitive assay），具体做法是：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。
应用
（1）鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；
（2）DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；
（3）通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；
（3）也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。
2 DNaseI足迹实验
足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。蛋白质结合在DNA特定片段上，能保护该部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。足迹试验特异性好，定位精确，使用广泛。
3 甲基化干扰实验
甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。
除了DNaseI 足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a. 自由羟基足迹实验；b. 菲咯啉铜足迹实验；c. DMS（硫酸二甲酯）足迹实验。
应用
（1）甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系。
（2）是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。
4 体内足迹实验
上面介绍的三种研究蛋白质与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处：在体外进行实验，可想而知，这些实验结果未必能反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。
为了解决这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（invivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。
体内足迹试验的原理原则同体外DMS足迹实验无本质差别，即:
（1）DMS能够使G残基甲基化。
（2）六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基。
（3）同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割。
（4）同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。
二 蛋白质与蛋白质相互作用
蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，对调控细胞及其信号有重要意义。研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。检测蛋白质间相互作用的实验方法有很多，究竟有哪些呢？小编总结了一个表格。
技术 | 原理 | 优点 | 缺点 |
酵母双杂交系统 | 当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。 | 蛋白质有可能保持天然的折叠状态，敏感度高，简捷 | 假阳性；融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录 |
噬茵体展示技术 | 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA 序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合 | 高通量，简便，直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合 | 须经过细菌转化、噬菌体包装；文库中分子遗传的多样性有局限性，有些序列不能表达，对细胞有毒性的分子不能表达和展示 |
Pull down 技术 | 将靶蛋白-GST/his融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白 | 可从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系，简单易行，操作方便 | 假阳性 |
免疫共沉淀 （CoIP） | 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法 | 蛋白处于天然状态，可以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体 | 不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白；灵敏度低 |
Far -Western （亲和印记） | 将PAGE 胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影 | 可检测不需要自然折叠状态的蛋白质之间的相互作用 | 转膜前需要将蛋白复性 |
等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance，SPR） | 利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。 | 不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析 | 需要专门的等离子表面共振检测 仪器。 |
荧光共振能量转移技术(FRET) | 指两个荧光法色基团在足够近（ <100 埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。 | 可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度 | 此项技术要求发色基团的距离小于100 埃，设备昂贵，还需要融合GFP 给蛋白标记。 |
蛋白质芯片阵列技术 | 对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析 | 可直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析，可同时快速发现多个生物标记物，小量样品，高通量， | 芯片制备复杂，蛋白质的非特异性结合，灵敏度和分辨率低 |
三 蛋白定量
1 蛋白浓度检测方法比较
方法 | 原理 | 灵敏性 | 干扰因素 | 应用 |
Lowzy法 （Folin-酚试剂法） | 在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系测定样品中蛋白质的浓度 | 较高约5µg/mL，最高可达1-1500 µg/mL | 适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂，如SDS，硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇等的干扰 | 耗时时间长达40-50min；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质而变化；标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差 |
Bradford法 | 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm有吸收峰，在一定范围内与蛋白质的含量呈线性关系 | 高约1~5 µg/mL微孔法测定范围为1-25 µg/mL；试管法测定范围为100-1500 µg/mL | 易受强碱性缓冲液，TritonX-100，SDS等去污剂的影响 | 快速，5-15min；颜色稳定；标准曲线有轻微的非线性 |
BCA法 | 在碱性条件下，蛋白将Cu2＋还原为Cu+, Cu＋与 BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 | 很高0.5-20 µg/mL微孔法可测范围为0.5-10 µg/mL；试管法可测范围20-2000 µg/mL | 不易受一般浓度去污剂的干扰，但受整合剂(EDTA，EGTA)、还原剂(DTI，巯基乙醇)和脂类的影响 | 较快，40min内，抗干扰能力强 |
2 SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠 ）。SDS是一种阴离子去垢剂， 带负电荷。蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合，形成 SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度主要取决于蛋白质分子大小。
凝胶直接染色：观察靶蛋白是否表达及表达量情况，也可以检测未知蛋白的表达。
考染：灵敏度底、检出>0.3—11 μg/ 带，但可褪色回收 。
银染：灵敏度高、可检出2 2—5ng/带
转到膜上再染色：丽春红染色等
3 Westen Blot
Westen Blot是最重要的蛋白质组学技术之一，是研究蛋白的小伙伴们必备的技能。
原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Westen印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特意敏感等多种特点，可检测低至1~5ng（最低可到10-199pg）中等大小的靶蛋白。过程主要包括：蛋白提取与定量，蛋白变性，SDS-PAGE，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显影。
一般我们使用WB 都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，其并不是一种定量的方法，只能在蛋白上样量相对一致时半定量的检测蛋白的相对表达强度，一般要设置内参照以使实验结果更加准确，然后采用灰度分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，同一样品至少重复三次才有统计学意义。
WB常用内参：
内参名称 | 分子量大小 | 适用范围 |
Beta-actin | 43 kDa | 胞浆和全细胞 |
GAPDH | 30-40 kDa | 胞浆和全细胞 |
Tubulin | 55 kDa | 胞浆和全细胞 |
VCDA1/Porin | 31 kDa | <p style="border: 0px; margin-top: 0.63em; margin-bottom: 1.8em; counter-reset: list-1 0 lis |
