药品中特殊杂志检查方法--色谱法
(1)薄层色谱法
TLC具有简便、快速、灵敏、不需特殊设备等优点,在杂质检查中应用广泛。有如下常用方法。
①杂质对照品法 适用于待检杂质已经确定,并且具备该杂质的对照品的情况。
方法:根据杂质限量,取一定浓度已知杂质的对照品溶液和供试品溶液,分别点在同一薄层板上,展开,显色定位,检查,供试品溶液所显杂质斑点与杂质对照溶液主斑点进行比较。
例如:异烟肼中游离肼的检查,取本品,加溶剂制成每1ml中含100mg的溶液,作为供试品溶液,另取硫酸肼加溶剂制成每1ml中含0.08mg(相当于游离肼20μg)的溶液,作为对照品溶液,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开,晾干,显色,检视。在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应的位置上,不得显黄色斑点。
②供试品溶液自身稀释对照法 适用于杂质不确定,或杂质已知但没有杂质对照品的情况,该法仅限于杂质斑点颜色与主成分斑点颜色相同或相近的情况。
方法:将供试品溶液按限量要求稀释成一定浓度作为对照溶液,将对照品溶液和供试品溶液分别点在同一薄层板上,展开,显色定位,检查,供试品溶液所显杂质斑点与对照溶液主斑点进行比较,不得更深。
例如:布洛芬中有关物质检查,取本品,加三氯甲烷制成每1ml中含100mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取适量,用三氯甲烷定量稀释制成每1ml中含1mg的溶液,作为对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开,晾干,显色,检视。供试品溶液如显杂质斑点,与对照溶液的主斑点比较,不得更深。
③杂质对照品与供试品溶液自身稀释对照并用法 适用于药物中存在多个杂质时,其中已知杂质有对照品,采用杂质对照品法检查,共存的未知杂质或没有对照品的杂质,则同时采用供试品溶液自身稀释对照法检查。
④对照药物法 适用于无杂质对照品,或者供试品的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异的情况。
方法:采用与供试品相同的药物作为对照。对照药物中所含待检杂质需符合限量要求,稳定性好。
例如:马来酸麦角新碱中有关物质检查,取供试品,精密称定,加乙醇-浓氨溶液(9:1)溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液与每1ml中含0.2mg的溶液,分别作为供试品溶液A和B,另取马来酸麦角新碱对照品,精密称定,用上述溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液,作为对照品溶液C,照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于硅胶G薄层板上,展开,晾干检视,溶液A主斑点的位置和颜色应与溶液C的主斑点相同,所显杂质斑点,其颜色不得深于溶液C对应的杂质斑点,并不得有溶液C以外的杂质斑点;溶液B除主斑点外,不得显任何杂质斑点。
(2)高效液相色谱法(HPLC)
HPLC具有分离效能高、专属性强、灵敏度高、可以准确测定各组分的峰面积等优点,在杂质检查中应用日益增多。有如下常用方法。
①外标法 适用于有杂质的对照品,进样量能精确控制的情况。
方法:配制杂质对照品溶液和供试品溶液,分别取一定量注入色谱仪,测定杂质对照品和供试品溶液中杂质峰的响应,按外标法计算杂质限量。
例如:阿司匹林中水杨酸的检查,精密量取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如显水杨酸色谱峰,按外标法以峰面积计算供试品中水杨酸含量,含水杨酸不得过0.1%。
②不加校正因子的主成分自身对照法 适用于没有杂质的对照品的情况。
方法:将供试品溶液稀释配制对照溶液并调节仪器灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。
例如:利巴韦林中有关物质的检查,取本品,加流动相溶解并制成每1ml中约含0.4mg的溶液作为供试品溶液,精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,单个杂质的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍(0.25%),各杂质峰面积的和不得大对照溶液的主峰面积(1.0%)。
③加校正因子的主成分自身对照法 适用于已知杂质的情况,本法优点是既省去了杂质对照品,又考虑到了杂质与主成分响应因子的不同所引起的测定误差,准确度好。
方法:将供试品溶液稀释成和规定中限度相当的溶液作为对照溶液,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,记录色谱图。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。
例如:红霉素A中红霉素B、C组分的检查,取本品,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(15:1)溶解并稀释制成每1ml中约含4mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取5ml,置100ml量瓶中,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(15:1)稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照红霉素A组分项下的色谱条件,精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl,分别注人液相色谱仪,记录色谱图。红霉素B按校正后的峰面积计算(乘以校正因子0.7)和红霉素C峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(5.0%)。
④面积归一化法 只适用于供试品中结构相似、相对含量较高且限度范围较宽的杂质含量的粗略考查。
方法:取供试品溶液进样,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。测定各杂质及药物的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率,不得超过限量。
例如:头孢呋辛酯中异构体的检查,在含量测定项下记录的供试品溶液色谱图中,头孢呋辛酯A异构体峰面积与头孢呋辛酯A、B异构体峰面积和之比应为0.48～0.55。
(3)气相色谱法
GC用于药物中挥发性特殊杂质的检查。常用的检查方法与HPLC类似。
例如:樟脑中有关物质的检查,取本品适量,加正庚烷溶解并稀释成浓度约为100mg/ml和1mg/ml的溶液,分别作为供试品溶液和对照溶液;另取3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇与乙酸龙脑酯各适量,加正庚烷溶解并稀释制成每1ml中各约含0.5mg的混合溶液,作为系统适用性试验溶液。按照气相色谱法试验,以聚乙二醇20M(或极性相近)为固定液,FID检测,各进样1μl,注入气相色谱仪,3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇峰与乙酸龙脑酯峰之间的分离度应大于2.0;用对照溶液调节检测灵敏度,使主成分峰高约为满量程的20%;供试品溶液如有杂质峰,单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%),各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍(4.0%)。
