药品中特殊杂志检查方法介绍
1.物理法
(1)臭味及挥发性差异
利用药物中存在的杂质具有特殊臭味,判断该杂质的存在。
例如:麻醉乙醚中检查异臭,取本品10ml,置瓷蒸发器中,使自然挥发,挥散完毕后不得有异臭。
(2)颜色差异
利用某些药物无色,而其分解产物有色,或从生产中引入了有色的有关物质,可通过检查供试品溶液的颜色来控制其有色杂质的量。
例如:葡萄糖的颜色检查,取本品5.0g,加热水溶解后,放冷,用水稀释至10ml,如显色,与对照液1.0ml加水稀释至10ml比较,不得更深。
(3)溶解行为差异
利用药物和杂质溶解行为的差异进行检查。
例如:葡萄糖中糊精的检查,利用葡萄糖可溶于热乙醇,而糊精溶解度小,检查乙醇溶液的澄清度,规定取本品1.0g,加乙醇20ml,置水浴上加热回流约40min,要求溶液应澄清。
(4)旋光法差异
药物在制备过程中易引入光学异构体,利用它们旋光性质的差异,通过测定旋光度可以控制杂质的限量。例如:硫酸阿托品中莨菪碱的检查,利用硫酸阿托品为消旋体,无旋光性,而莨菪碱为左旋体,规定供试品溶液(50mg/ml)的旋光度不得过-0.4°,以控制莨菪碱的量。
2.化学法
(1)显色反应
利用杂质与一定试剂反应产生颜色进行检查。
例如:盐酸吗啡中罂粟酸的检查,利用罂粟酸在微酸性溶液中与三氯化铁生成红色罂粟酸铁,规定取本品0.15g,加水5ml溶解后,加稀盐酸5ml与三氯化铁试液2滴,不得显红色。
(2)沉淀反应
利用杂质与一定试剂反应产生沉淀进行检查。
例如:氯化钠中钡盐的检查,利用钡离子与硫酸根离子生成沉淀,而药物不干扰的特点,规定取本品4.0g,加水20ml溶解后,滤过,滤液分为两等份,一份中加稀硫酸2ml,另一份中加水2ml,静置15min,两液应同样澄清。
(3)气体反应
利用杂质与一定试剂反应产生气体进行检查。
例如:氧化镁中碳酸盐的检查,利用碳酸盐加醋酸即生成醋酸镁和二氧化碳的特性,规定取本品0.10g,加水5ml,煮沸,放冷,加醋酸5ml,不得泡沸。
(4)酸碱性的差异
利用药物与杂质酸碱性的差异对药物中的杂质进行检查。
例如:维生素E的酸度检查,取乙醇与乙醚各15ml,置锥形瓶中,加酚酞指示液0.5ml,滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)至微显粉红色,加本品1.0g,溶解后,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定,消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)不得过0.5ml。
(5)氧化还原性的差异
利用药物与杂质的氧化性或还原性的差异对药物中的杂质进行检查。
例如:盐酸吗啡中阿扑吗啡的检查,利用阿扑吗啡还原性强,其水溶液在碳酸氢钠碱性条件下,经碘试液氧化,生成水溶性绿色化合物,此产物能溶于乙醚,乙醚层显深宝石红色,水层仍显绿色的特点,规定取本品50mg,加水4ml溶解后,加碳酸氢钠0.10g与0.1mol/L碘溶液1滴,加乙醚5ml,振摇提取,静置分层后,乙醚层不得显红色,水层不得显绿色。
3.光谱法
(1)紫外分光光度法
利用药物与杂质紫外特征吸收的差异进行检查。
例如:肾上腺素中酮体的检查,利用酮体在310nm处有较强吸收,而肾上腺素在此波长处无吸收的特点。规定取本品加盐酸(9→2000)制成每1ml中含2.0mg的溶液,照紫外可见分光光度法,在310nm波长处测定,吸光度不得过0.05。已知酮体在该波长处吸收系数()为453,通过计算可知控制酮体的限量为0.06%。再如两性霉素B中两性霉素A的检查,利用两性霉素A在305nm处吸收最强,而两性霉素B在此波长处几乎无吸收。规定取本品,加少量二甲基亚砜溶解后,加甲醇定量稀释制成每1ml中含100μg的溶液,照紫外-可见分光光度法,在305nm波长处测定吸光度,不得过0.40。
(2)原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法是一种灵敏度高、专属性强的测定方法,主要用于微量金属元素的测定。通常采用标准加入法控制药物中金属杂质的限量:取供试品,按各品种项下的规定,制备供试品溶液;另取等量的供试品,加入限度量的待测元素溶液,制成对照品溶液。设对照溶液的读数为a,供试品溶液的读数为b,b值应小于(a-b)。
例如:碳酸锂中钾的检查。取本品0.10g两份,分别置50ml量瓶中,各加盐酸溶液(1→2)10ml溶解后,一份中加水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另一份中加标准氯化钾溶液3.0ml,并用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照原子吸收分光光度法,在766.5nm波长处测定,应符合规定。
(3)红外分光光度法
红外分光光度法在杂质检查中,主要用于药物中无效或低效晶型的检查。某些多晶型药物由于晶型结构不同,某些化学键的键长、键角发生不同程度的变化,导致红外吸收光谱中的某些特征带的频率、峰形和强度出现显著差异。利用这些差异,可以检查药物中低效或无效晶型的检查,结果可靠。
例如:甲苯咪唑中A晶型的检查,甲苯咪唑有三种晶型,其中C晶型为有效晶型,在640cm-1吸收很弱,在662cm-1有强吸收,无效A晶型在这两个波数处的吸收情况正好相反,故当供试品中含有A晶型时,在上述两波数处的吸光度比值将发生变化。中国药典采用供试品与含A晶型为10%的甲苯咪唑对照品同法操作,供试品在640cm-1与662cm-1波数处吸光度之比不得大于对照品在该波数处的吸光度之比的方法控制A晶型的量。
4.色谱法
(1)薄层色谱法
TLC具有简便、快速、灵敏、不需特殊设备等优点,在杂质检查中应用广泛。有如下常用方法。
①杂质对照品法 适用于待检杂质已经确定,并且具备该杂质的对照品的情况。
方法:根据杂质限量,取一定浓度已知杂质的对照品溶液和供试品溶液,分别点在同一薄层板上,展开,显色定位,检查,供试品溶液所显杂质斑点与杂质对照溶液主斑点进行比较。
例如:异烟肼中游离肼的检查,取本品,加溶剂制成每1ml中含100mg的溶液,作为供试品溶液,另取硫酸肼加溶剂制成每1ml中含0.08mg(相当于游离肼20μg)的溶液,作为对照品溶液,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开,晾干,显色,检视。在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应的位置上,不得显黄色斑点。
②供试品溶液自身稀释对照法 适用于杂质不确定,或杂质已知但没有杂质对照品的情况,该法仅限于杂质斑点颜色与主成分斑点颜色相同或相近的情况。
方法:将供试品溶液按限量要求稀释成一定浓度作为对照溶液,将对照品溶液和供试品溶液分别点在同一薄层板上,展开,显色定位,检查,供试品溶液所显杂质斑点与对照溶液主斑点进行比较,不得更深。
例如:布洛芬中有关物质检查,取本品,加三氯甲烷制成每1ml中含100mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取适量,用三氯甲烷定量稀释制成每1ml中含1mg的溶液,作为对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开,晾干,显色,检视。供试品溶液如显杂质斑点,与对照溶液的主斑点比较,不得更深。
③杂质对照品与供试品溶液自身稀释对照并用法 适用于药物中存在多个杂质时,其中已知杂质有对照品,采用杂质对照品法检查,共存的未知杂质或没有对照品的杂质,则同时采用供试品溶液自身稀释对照法检查。
④对照药物法 适用于无杂质对照品,或者供试品的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异的情况。
方法:采用与供试品相同的药物作为对照。对照药物中所含待检杂质需符合限量要求,稳定性好。
例如:马来酸麦角新碱中有关物质检查,取供试品,精密称定,加乙醇-浓氨溶液(9:1)溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液与每1ml中含0.2mg的溶液,分别作为供试品溶液A和B,另取马来酸麦角新碱对照品,精密称定,用上述溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液,作为对照品溶液C,照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于硅胶G薄层板上,展开,晾干检视,溶液A主斑点的位置和颜色应与溶液C的主斑点相同,所显杂质斑点,其颜色不得深于溶液C对应的杂质斑点,并不得有溶液C以外的杂质斑点;溶液B除主斑点外,不得显任何杂质斑点。
(2)高效液相色谱法(HPLC)
HPLC具有分离效能高、专属性强、灵敏度高、可以准确测定各组分的峰面积等优点,在杂质检查中应用日益增多。有如下常用方法。
①外标法 适用于有杂质的对照品,进样量能精确控制的情况。
方法:配制杂质对照品溶液和供试品溶液,分别取一定量注入色谱仪,测定杂质对照品和供试品溶液中杂质峰的响应,按外标法计算杂质限量。
例如:阿司匹林中水杨酸的检查,精密量取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如显水杨酸色谱峰,按外标法以峰面积计算供试品中水杨酸含量,含水杨酸不得过0.1%。
②不加校正因子的主成分自身对照法 适用于没有杂质的对照品的情况。
方法:将供试品溶液稀释配制对照溶液并调节仪器灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。
例如:利巴韦林中有关物质的检查,取本品,加流动相溶解并制成每1ml中约含0.4mg的溶液作为供试品溶液,精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,单个杂质的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍(0.25%),各杂质峰面积的和不得大对照溶液的主峰面积(1.0%)。
③加校正因子的主成分自身对照法 适用于已知杂质的情况,本法优点是既省去了杂质对照品,又考虑到了杂质与主成分响应因子的不同所引起的测定误差,准确度好。
方法:将供试品溶液稀释成和规定中限度相当的溶液作为对照溶液,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,记录色谱图。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。
例如:红霉素A中红霉素B、C组分的检查,取本品,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(15:1)溶解并稀释制成每1ml中约含4mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取5ml,置100ml量瓶中,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(15:1)稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照红霉素A组分项下的色谱条件,精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl,分别注人液相色谱仪,记录色谱图。红霉素B按校正后的峰面积计算(乘以校正因子0.7)和红霉素C峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(5.0%)。
④面积归一化法 只适用于供试品中结构相似、相对含量较高且限度范围较宽的杂质含量的粗略考查。
方法:取供试品溶液进样,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。测定各杂质及药物的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率,不得超过限量。
例如:头孢呋辛酯中异构体的检查,在含量测定项下记录的供试品溶液色谱图中,头孢呋辛酯A异构体峰面积与头孢呋辛酯A、B异构体峰面积和之比应为0.48～0.55。
(3)气相色谱法
GC用于药物中挥发性特殊杂质的检查。常用的检查方法与HPLC类似。
例如:樟脑中有关物质的检查,取本品适量,加正庚烷溶解并稀释成浓度约为100mg/ml和1mg/ml的溶液,分别作为供试品溶液和对照溶液;另取3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇与乙酸龙脑酯各适量,加正庚烷溶解并稀释制成每1ml中各约含0.5mg的混合溶液,作为系统适用性试验溶液。按照气相色谱法试验,以聚乙二醇20M(或极性相近)为固定液,FID检测,各进样1μl,注入气相色谱仪,3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇峰与乙酸龙脑酯峰之间的分离度应大于2.0;用对照溶液调节检测灵敏度,使主成分峰高约为满量程的20%;供试品溶液如有杂质峰,单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%),各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍(4.0%)。
