荧光显微成像在生物分析中的应用
论文摘自山东师范大学化学化工与材料科学学院，济南 250014
摘 要 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统可获取显微荧光成像及微区荧光光谱、荧光寿命的测定信息，广泛应用于细胞、组织中蛋白质的结构功能分析，核酸的识别检测，金属离子、自由基的定量测定，以及纳米生物探针的研制等生物分析研究的热点领域。
1 引 言
荧光显微镜在生物学和医学领域已得到了广泛应用，是观测细胞形态、结构和生命现象的有力工具。荧光显微镜作为一种必不可少的分析手段，常用于定性观察细胞内部荧光物质的空间分布和强度分布，得到细胞的荧光图像，研究细胞的结构。然而荧光显微镜不能定量给出图像发光的强度数值，无法研究细胞图像发光强度变化不大或荧光物质空间分布变化细微的生理过程。因此，随着生物医学的飞速发展，迫切需要有更高灵敏度，操作更快捷，功能更加完备的仪器来满足生物学和医学研究发展的要求。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合而成的系统仪器能够获取显微荧光成像及微区荧光强度、荧光寿命的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记，荧光探针的亮度即荧光强度可反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像采集后，荧光光谱仪可测量图像的荧光强度，对获取的图像进行荧光强度的定量，为全面分析和研究细胞内部结构提供更加详尽的数据信息。
2 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统及特点
应用单臂光纤连接荧光显微镜与荧光光谱仪，实现荧光光谱测量和细胞实时成像二维信号的同时采集。以高频脉冲激光器作为激发光源激发显微镜下样品，使之发射出可见范围内的波长，呈现荧光映像。用荧光显微镜的物镜收集信号，通过单臂光纤将耦合好的荧光信号从荧光显微镜传导至荧光光谱仪，记录荧光发射光谱。电感耦合相机（charged coupled device，CCD）摄像系统作为光电传感器用于显微镜图像获取技术采集细胞图像，并将图像信号转换成电信号输入计算机进行数据读取及图像处理，获取微区荧光光谱扫描谱图的详细信息，并对图像进行采集、曝光调整、多色彩空间的影像编辑、预定义的影像设置、自动调焦、自动后处理加工调整，获得色彩鲜艳、清晰度高的影像。应用光纤耦合荧光光谱仪与荧光显微镜，配合荧光图像扫描显微荧光光谱及进行微区荧光寿命的测定（超高时间分辨率，可得到复合物中不同组分的荧光寿命），优化升级了作为单一仪器的功能。红敏光电倍增管（PMT）和红外PMT 切换使用满足超宽光谱范围探测（200 ～1700 nm），适合从紫外到近红外波段荧光光谱的特性研究，为生物体系中近红外荧光探针的开发应用研究提供了有力的支持。
3 生物分析中的应用
荧光探针是设计用来进行生物标本特定区域内定位或对特定刺激反应的荧光团，可以高度敏感性和选择性的检测复杂生物分子及活细胞中的特定成分。相对于常规荧光检测而言，在近红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质（如组织）的光散射明显降低，激发光的穿透性更强，因而自发荧光的背景干扰显著降低。荧光探针由于其特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点，且其测定条件适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学研究领域。设计近红外荧光探针引入组织和细胞，富集在组织和细胞的特定成分中，在荧光显微镜下不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、生物大分子等进行实时观察和检测，配合荧光光谱仪获取荧光图像的量化信息。因此，荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统在生物分析领域中将具有广泛的应用前景。
蛋白质结构和功能分析及核酸的识别检测
生物体内细胞的生理状态受内部和外部因素的影响，可通过基因表达和后续的蛋白质表达表现出来。因此，蛋白质的结构与功能研究是认识生命过程的关键。活细胞内蛋白质的显微荧光成像分析是生物显微技术的一个重要方面。Dawn 等成功设计合成了活细胞中定点标记N 端为半胱氨酸蛋白质的一系列荧光分子探针。这种荧光分子探针利用生理条件下含硫代酸酯的小分子可有效穿过细胞膜与 N 端为半胱氨酸的蛋白质进行化学选择性反应产生荧光，跟踪检测蛋白质的功能及相互作用。利用荧光显微镜观察了探针标记细胞的显微荧光成像，根据荧光光谱确定探针的发射波长处于近红外波段，适用于活细胞中蛋白质的荧光成像分析检测。
生命活动离不开酶的催化作用，机体内的物质代谢在酶的催化下有条不紊地进行。酶是由活细胞合成的，是能够对特异底物起高效催化作用的蛋白质。基于荧光的酶分析方法随着酶荧光探针的开发得以广泛应用，荧光显微镜常用于检测荧光酶细胞化学的作用。为了研究某些细胞内的生理过程，经常将荧光共振能量转移（FRET）与荧光显微技术结合起来。Mupam 等就通过荧光显微镜、CCD 和荧光光谱仪来进行完整细胞中 FRET 发生的定位，将细胞内的理化反应研究提高到细胞器的水平。Chi-wang等利用 FRET 工作原理设计的荧光探针包括一个对已知蛋白激酶特异性识别的底物结构域，一个与磷酸化丝氨酸底物结构相结合的磷酸化识别结构域。当底物结构被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，探针两端两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量转移。荧光光谱提供分子发生磷酸化前后的荧光强度变化，荧光显微镜获得 FRET 成像反映供体蛋白与受体蛋白之间的相互作用，做到活细胞内定时、定量、定位地观测蛋白激酶活性变化。
核酸是生命的信息物质，对蛋白质的合成、细胞分裂和复制以及生物遗传起着重要作用。荧光探针技术具备方法简便，灵敏度高等优点，结合荧光显微镜应用于核酸的定量分析、结构及作用机理的研究日益广泛。分子信标作为敏感、特异的核酸探针，通过空间结构改变决定发射荧光特性，实现活细胞中核酸的定位信息采集及定量检测，利用分子信标技术可以对生物大分子在活体内的代谢等动态过程进行跟踪分析。Santangelo 等设计了一对与待测目标 mRNA 序列互补的新型分子信标，制成脂质体使之摄入细胞，与目标 mRNA 杂化时产生 FRET，较之单一分子信标有效抑制了主动错误信息的检出，灵敏定量检测目标 mRNA。应用显微注射法注入活体细胞获取荧光显微成像，检测荧光强度实时反映活体 RNA 的代谢转移过程。
