分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

新型双压线性离子阱质谱仪给蛋白质组学带来革...（二）

2020.7.20

实验

样品制备

C.elgans 匀浆液的可溶性部分用 pH7.8 的碳酸氢铵稀释，加入 0.1% 的 RapiGest 表面活性剂，解释用二硫苏糖醇在 100 ℃ 还原二硫键，并用碘乙酰胺对半胱氨酸烷基化。样品解释用对 K/R 特异性酶酶切 4 个小时。酶解物质酸化后存放至 -80 ℃ 。在进入反相高效液相色谱 - 串联质谱前用 0.1% 的甲酸稀释。

液相色谱 - 串联质谱分析

为了比较和评估性能，在 Thermo Scientific 的 LTQ XL 线性离子阱质谱仪和安捷伦 6520 四级杆 - 飞行时间质谱仪一级 LTQ Velos 双压线性离子阱质谱仪对 C.elegans 的蛋白酶解物进行了分析，肽段混合物是在反相色谱进行分离的。详细的色谱条件请参照表 1 。同时对减少进样量进行了考察。

在所有实验中，均采用数据依赖的串联质谱采集方法。在每一台仪器上至少运行 3 次样品。

对于线性离子阱的数据依赖模式检测方法，该方法主要分析十个最强的离子，根据色谱峰的峰宽，优化排除条件，色谱峰的峰宽主要是根据反相梯度长度变化。由于在 LTQ Velos 质谱仪离子源有较好的离子传输，因此一级质谱全扫描需要较低的最大注射时间。在进行二级质谱扫描的时候，可用同样的最大注射时间，这样可以捕获更多的例子，进而鉴定得到低丰度的肽段（前体离子丰度较低， AGC 的注射时间达到最大）。在 LTQ Velos 前体离子的选择上采用数据依赖的模式，对一级质谱信号设置更高的阈值。离子转移管的温度为 250 ℃ ，比 LTQ XL 更高，目的是补偿短的毛细管长度。碰撞诱导解离的时间从 30ms 降至 10ms ，充分利用更高的压力池，提高碎裂效率。 LTQ Velos 双压离子阱对于正常扫描模式同时提供了碎裂效率和扫描速率，而且阻止了单电荷的前体离子的传输。在数据采集模式充分利用了这个特点，详细的采集参数如表 2 所示。

6520 四级杆飞行时间质谱仪（ Q-TOF ）的采集参数如表 3 所示。采用了 3Hz 和 6Hz 的扫描速率，以最大化实现对肽段进行鉴定，实际有效的扫描速率为 2.5Hz 或 5.1Hz 。参数设置参考了安捷伦的技术支持，同时也与推荐文献报道相类似。

数据库搜索

通过用 Thermo Scientific 蛋白质组学发现 1.0 （ Proteome Discovery) 软件和英国伦敦 Matrix Sciences 公司的 Mascot2.1 搜索引擎对数据进行检索，比较离子阱和四级杆 - 飞行时间质谱仪所采集的数据。用于数据库搜索的条件如表 4 所示。在 Mascot 中选中反相库检索选项，对所有的数据进行过滤，保证 1% 或更低的的假阳性率。用安捷伦的软件 Masshunter 将 6520 的四级杆 - 飞行时间质谱仪所采集的数据转换为 mzdata 格式，然后提交到蛋白质组学发现（ Proteome Discovery) 软件。 Proteome Discovery 软件会自动计算期望得分（或肽得分，如果选中的话）来过滤数据，达到满足特定的假阳性率，然后将该过滤方法应用到数据集中。

因此，选择高置信度的肽段过滤条件来使最终检测到的蛋白满足 1% 或更低的的假阳性率。将数据库检索得到的特异性肽段的数量和蛋白数进行比较。

仪器	Thermo Scientific 离子阱	Q-TOF （四级杆 - 飞行时间质谱）
HPLC （高压液相色谱）	Thermo Scientific Surveyor MS Pump	Agilent 1200 Series HPLC
离子源	Nanospray I	Agilent HPLC-Chip/MS System
分析柱	Michrom Magic C18AQ packed tip 150 mm x 75 μm I.D. x 15 μm tip 5 μm particle, 250 ?pore size	Agilent Protein ID Chip #3 (up to 4 μg capacity) SB-ZORBAX C18 150 mm x 75 μm I.D. 5 μm particle, 300 ?pore size
流速	~ 300 nL/min at 50% organic	300 nL/min
梯度	2-25% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)	5-30% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)

表 1 肽段一维反相色谱分离条件

质谱仪	LTQ Velos	(LTQ XL)
毛细管温度	250 °C	( 200 °C )
离子源参数	S-Lens 40%	(Tube Lens 100 V)
AGC Targets Full	MS: 3e4
	MSn: 1e4
最大注射时间	一级质谱 : 10 msec (Full MS: 50 msec)
	多级质谱 : 100 msec
一级质谱扫描范围	400 -1200 m /z
隔离宽度	2 m /z
碰撞类型	CID 碰撞诱导解离
归一化能力	30%
碰撞时间	10 msec	(30 msec)
缺省带电量	3
DDA 选择阈值	1000	(10,000)
方法	Top 10 most intense DDA
Number of Microscans	1
扫描速率	正常
排除单电荷	是	否
动态排除功能	Exclusion duration: 排除周期 15 sec (60 min), 30 sec (180 min) List size: 500
	Repeat count: 1 Mass width: low-1.0, high 1.5

表 2 ： LTQ Velos and LTQ XL 质谱仪采集参数

质谱仪	Agilent 6520 Q-TOF
ESI 条件	HPLC-Chip NSI Interface
芯片气体温度	300 °C
干燥器温度	4 L /min
一级质谱采集频率	3, 6, or 8 Hz
二级质谱采集频率	3 or 6 Hz
一级质谱扫描范围	200 -2000 m /z
碰撞能力	Slope: 3 V
	Offset: 2 V