农杆菌感受态的制备和转化
农杆菌感受态细胞主要用于将目的基因导入植物细胞。
实验方法原理 | 主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理,使农杆菌细胞膜的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、农杆菌感受态细胞的制备 1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养。 2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。 3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃ 220rpm振荡培养至OD600=0.5。 4. 转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清液。 5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min,去上清。 6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮。 7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200μl冻存于-70℃。 二、双元载体转化农杆菌EHA105 1. 取1 μg左右的质粒DNA加入到200 ml EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min,-70℃放置10min 。 2. 再在37℃水浴5min或42℃水浴1min。 3. 接着冰浴2min,加入800ml YM液体培养基。 4. 28℃,175rpm摇培3 hr后,涂在含50 μg/ml Kanamycin的YM平板上。 5. 28℃培养到形成单菌落。 注:其中 YM 可以用LB 代替 ,第一次的 CaCl2 溶液可用溶液(0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl(7.0) 0.01 DTT)替代。 |