QIAcuity数字PCR微生物检测方案

2022.4.30

微生物数量庞大，分布广泛。人体细胞总数为数十万亿个，而人体微生物总数为上百万亿个。其在口腔、皮肤、消化系统、分泌生殖系统均有分布，并且分布情况受种族、环境、性别、生活习惯等因素的影响。同时微生物贡献大量可供研究的基因 (~8×10⁶)，基因组功能具有复杂性，例如抗性基因、可稳定遗传的毒力因子等。因此微生物的检测及研究具有重要的意义。

QIAGEN最新上市的QIAcuity dPCR Microbial DNA Detection Assay，可识别680多种微生物靶标基因，涵盖细菌、真菌、寄生虫、病毒、抗生素耐药性或毒力因子基因等。五种荧光基团-FAM™、HEX™、TAMRA、ROX™、Cy5^®可供选择，单次反应中可最多检测五个靶标基因，其中部分靶标基因经过湿实验验证，可进行5-Plex dPCR组合。另外，可在单次反应中同时检测微生物DNA和病毒RNA。

该Assay推荐与QIAcuity Probe PCR Kit（针对DNA模板）或QIAcuity One-Step Advanced Probe PCR Kit（针对RNA或RNA+DNA模板）在QIAcuity数字PCR系统上搭配使用。简化的实验流程，简短的手动操作时间，可在两小时内获取结果。

表1. dPCR Microbial DNA Detection Assay 所涵盖的微生物

dPCR Microbial DNA Detection Assay 定量精确性

为验证dPCR Microbial DNA Detection Assay在QIAcuity dPCR系统上检测结果的准确性，我们对索氏志贺菌的基因组DNA（NIST参照标准品8376）进行定量。结果显示，测得的靶标基因浓度（copies/μl）与预期浓度相吻合（如图2所示）。图3所示为两种细菌靶标基因（粪肠球菌和索氏志贺菌）定量线性动态范围可跨越4个数量级（低至0.4copies/μl）。

图2. 标准品精确定量

以S. sonnei基因组DNA作为模板进行定量（NIST标准品8376）。S. sonnei单拷贝靶标基因dPCR检测结果显示，在梯度稀释中 (1X – 10000X) 中，实际检测结果与预期相比显示出精确的绝对定量性能。深蓝色柱形图为三个重复的平均检测值 (copies/μl) 和误差线。

图3. 靶标基因定量线性动态范围可跨越4个数量级

A：一维散点图：粪肠球菌和索氏志贺菌的5个模板稀释系列和1个无模板对照（每个样品3个技术重复），模板为细菌gDNA。
B：测得的平均浓度值 (copies/μl) 与模板浓度值之间线性关系图。R2值表示二者之间有很强的正线性关系。

该实验在QIAcuity数字PCR系统上使用26K 24孔纳米微孔板进行。

dPCR Microbial DNA Detection Assay 单通道和多通道高精确性、高特异性

多种经湿实验验证的5-plex组合可供选择，dPCR Microbial DNA Detection Assay在单通道和多通道检测中性能相当（图4）。图5显示为在多通道检测中阳性信号与背景信号分离情况。图6显示为五种水中病原微生物的多通道检测结果。

图4. 单通道和多通道dPCR四种细菌定量结果

相同的基因组DNA，分别使用单通道和4通道进行dPCR检测。结果显示，模板浓度在0.2-2500copies/µl 之间时，二者结果基本一致。

该实验在QIAcuity数字PCR系统上使用26K 24孔纳米微孔板进行。

图5. 多通道检测中，通道之间信号显著分离情况

针对四种细菌抗性基因、4通道检测的二维散点图

该实验在QIAcuity数字PCR系统上使用26K 24孔纳米微孔板及QIAcuity PCR Probe Kit进行。

dPCR Microbial DNA Detection Assay 可同时检测病毒RNA和微生物DNA

与最新款QIAcuity One-Step Advanced Probe Kit搭配使用，dPCR Microbial DNA Detection Assay可检测RNA靶标基因，或同时检测RNA和DNA靶标基因。该功能对于一些应用检测大有裨益，例如同时检测DNA病毒和RNA病毒。

图7所示为SARS-CoV-2（N1）RNA靶标基因和四种细菌靶标基因多通道同时检测。也可以仅检测多种病毒靶标基因，例如SARS-CoV-2和流感病毒或诺如病毒的多通道检测（数据未显示）。

图6. 水中病原微生物五通道检测

一维散点图为四个不同病原菌模板混合物和一个无模板对照（NTC）的五通道反应。每种gDNA Mix包含不同种类的gDNA（来自5种中的4种）（红叉表示缺失的）；Mix1缺少钩端螺旋体致病菌模板；Mix 2缺少嗜肺军团菌模板；Mix 3缺少小肠结肠炎耶尔森氏菌模板；Mix 4缺少霍乱弧菌模板（每个样品3个技术重复）。在五通道检测中，每个DNA靶标基因均被精确定量。

该实验在QIAcuity数字PCR系统上使用8.5K 24孔纳米微孔板及QIAcuity PCR Probe Kit进行。