lncRNA研究之RNA pull-down问答集锦

　　新开通了博客，说是写点东西，刚好最近在学习理解非编码RNA相关技术，简单梳理了RNA pull down实验中遇到的问题，可能不够全面，也希望群友们给些建议，互相交流。

　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的科研价值和意义。其中RNA Pull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。

　　RNA Pull-down结合了体外转录与生物素标记、质谱技术，是研究非编码RNA与蛋白质相互作用的一大利器。由于实验程序较多、RNA的易降解性，加上一些不可预知的变量，因此实验存在一些难度，常常导致实验的失败。对于试验中常常出现的棘手的问题，http://http://www.genecreate.cn/RNA_pull_down/经过实践，总结了一套行之有效的应对方策，现在一起来看看吧！
1、RNA Pull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊？

    ①选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低；

　　②体外转录得到的RNA降解或者不是全长；

　　③Pull-down实验孵育时间不长；

　　④其他

2、PAGE电泳银染背景深？

　　①样品杂蛋白太多；

　　②银染显色时间过长；

　　③其他
3、RNA Pull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白：

　　①选取的RNA序列不对；

　　②样品中没有表达互作的蛋白质；

　　③互作蛋白浓度低，银染图肉眼观察不到差异条带；

　　④其他

　　①lncRNA序列前期验证要完善；

　　②选择相应蛋白质表达量较高的组织或细胞样品；

　　③体外转录选择转录质量高的试剂盒，操作过程避免Rnase的污染；

　　④保证RNA Pull-down实验中探针标记以及探针与蛋白的结合充分进行（依据体外转录RNA的量，样品裂解液蛋白浓度）；

　　⑤尽可能多将洗脱的蛋白电泳（同时可以避免显色时间过长）

　　其他原因，欢迎交流！如果您在RNA Pull-down实验中遇到困惑，可以随时@qq3268908524，下期我们再通过解读一篇文献中MS2 RIP、RNA Pull-down的技术应用，进一步探讨，再见！