醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质(一)

关键词:浊度标准物质  食品检测  农药多残留分析  环境监测标准样品
    【实验原理】
    血清中各种蛋白质的等电点(pI)大都低于8.6,在pH 8.6的缓冲液中,电离成负离子,在电场中向正极移动。因各种蛋白质pI不同,在同一pH下带电荷量有差异,同时各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同,因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多,分子量小者,泳动较快;反之则较慢。
    醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白分离为5条区带,从正极端起依次为白蛋白、α1-球  蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比,因此将各蛋白区带剪下,经脱色、比色或经透明处理后直接用光密度计扫描,即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总蛋白浓度,还可计算出各蛋白组分的绝对浓度。
    【试剂与器材】
    1.巴比妥缓冲液(pH 8.6,离子强度0.06)称取巴比妥钠12.36g、巴比妥2.21g,于500mL蒸馏水中加热溶解,冷却至室温后,用蒸馏水定容至1L。
    2.染色液
    (1)丽春红S染色液:称取丽春红S 0.4g、三氯醋酸6g,溶于蒸馏水中并定容至100mL。
    (2)氨基黑10B染色液:①第一种配方(推荐配方):称取氨基黑10B 0.1g,溶于20mL无水乙醇中,加冰醋酸5mL,甘油0.5mL;另取磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中,加入前液,混和摇匀,再以蒸馏水补足至100mL。②第二种配方:称取氨基黑10B 0.5g溶解于50mL甲醇中,加入冰醋酸10mL和蒸馏水40mL,混合即成。
  3.漂洗液
  (1)3%(V/V)醋酸溶液,适用于丽春红S染色的漂洗。
  (2)甲醇45mL,冰醋酸5mL,蒸馏水50mL,混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。
  4.透明液
  (1)液体石蜡或氢萘的润湿透明法,均十分方便。
  (2)冰醋酸:95%乙醇=2.7:7.5的混合液。
  (3)N-甲基-2-吡咯烷酮.柠檬酸(3.03mol/L N-甲基-2-吡咯烷酮,0.15mol/L柠檬酸):称取柠檬酸15g溶于150mL水中,加入N-甲基-2-吡咯烷酮150mL,混匀,加蒸馏水至500mL。
    5.洗脱液
(1)0.1mol/L NaOH溶液,适用于丽春红S染色的洗脱。
(2)0.4mo1/L NaOH溶液,适用于氨基黑10B染色的洗脱。
6.电泳仪  电子管或晶体管整流的直流电源,电压0~600V,电流0~300mA。
7.电泳槽  铂(白金)丝电极的水平电泳槽。
8.加样器  血红蛋白管和0.2cm×1.5cm有机玻璃片或X线胶片或特制电泳加样器。
9.染色皿、漂洗皿、镊子。
10.光密度计、721分光光度计。
11.醋酸纤维素薄膜  规格2cm×8cm(比色法),6cm×8cm(扫描法)。