光敏生物素试剂盒杂交实验
实验概要
Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。它可用于基因组特定DNA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。下面分别利用光敏生物素试剂盒进行杂交的方法。
主要试剂
硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA（100ug/ml）
20×SSC溶液 氯化钠 3M 预杂交液 6×SSC
柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）
pH 7.0 5×Denhardt's 溶液
0.5%SDS
变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCl pH 7.4
1.5M NaCl 1.5M NaCl
封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0，煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5，加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCl pH7.5，MgCl2 0.19%，NaCL 5.8%，Triton X-100 0.05ml）定容至100ml
50×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCl 0.8% pH 7.4
1%BSA KCl 0.02%
1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%
KH2PO4 0.024%
洗涤液
A: 2×SSC，250ml中含0.1%SDS B：0.1×SSC，250ml中含0.1%SDS
C：Tris-HCl 100mM pH 7.5 D：Tris-HCl 100mM
NaCl 1M NaCl 0.5M
MgCl2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5
Triton X-100 0.05%
亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCl 100mM
NaCl 1M
MgCl2 2mM
Triton X-100 0.05%
pH 7.5
碱性磷酸酶 2-3单位/ml
底物溶液 Tris-HCl 100mM pH 9.5 终止液
NaCl 100mM Tris-HCl 10mM
MgCl2 5mM EDTA 1mM
主要设备
分子杂交仪、摇床、 烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽
实验步骤
1. 转膜
1) 电泳
2) 切胶 在紫外下，切取凝胶有条带部分
3) 脱嘌啉0.25NHCl浸泡凝胶10分钟，蒸馏水洗胶（大于15kb的DNA片段转移时做此步骤）
4) 变性，变性液（0.5MNaOH、1.5MNaCl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶
5) 中和，中和液（0.5MTris-HCl，pH7.0、3MNACl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶
6) 平衡，凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟
7) 转膜，取一塑料盒，将一干净玻璃板横架于盒上，盒中倒入10×SSC，作为转移缓冲液，将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿，放置于玻璃板上，作为滤纸桥
将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记，胶面反转放置于滤纸桥上，四周用Parafilm膜封闭，以防短路
剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜（NC膜），以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上
剪取2块相应大小的滤纸，以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上
（滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡）
滤纸上面放一叠吸水纸，上面压一块玻璃板，再压上500g左右的重物，转移过夜
8) 烤膜，转移结束后，NC膜在与凝胶切角相对处，用铅笔做记号，用6×SSC溶液室温漂洗5分钟，以充分洗去沾上的凝胶成分，吸水纸吸干残余液体，室温晾干，NC膜用滤纸夹裹好，80℃烤膜2小时
9) 烤干的NC膜用２×SSC浸润。
2. 杂交
1) 封闭，将杂交好的NC膜用滤纸吸干，放入一新杂交袋中，用封闭液４２℃封闭２－４小时（封闭液用量为４ml/50cm2膜）。
2) 预杂交，将上部浸润的NC膜装入杂交袋，加入预杂交液（0.2ml/cm2膜），使膜与预杂交液充分混匀，赶走汽泡，封口。65℃２－４小时。
3) 杂交，倾出预杂交液，加入杂交液（预杂交液＋临用前变性的标记好探针，终浓度为1-2ng/ml）（0.2ml/cm2膜），65℃过夜。
4) 洗膜，用洗涤液Ａ，Ｂ分别洗膜两次，每次洗膜液体积不少于250ml。
5) 反应，弃去封闭液，加入亲和素－碱性磷酸酶溶液，室温避光反应１５分钟，轻轻震荡。取出膜，用洗涤液Ｃ，Ｄ分别洗涤三次，每次洗涤体积不应少于300ml，每次5分钟，振荡。
6) 显色，将膜转入新袋中，加入底物溶液（用量为４ml/50cm2膜）。封袋，避光放置，显色数分钟至数小时，以杂交带清晰，背景低为好。
注意事项
1. 在７操作中每层间应确保无汽泡存在。
2. 操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸，且不能于滤纸下的任何一层接触。
3. 烤片的作用在于使已转移条带更牢地结合于NC膜上。
