地高辛对探针的标记
实验概要
本实验拟通过随机引物及PCR方法，将DNA探针片段用DIG标记，进一步掌握探针的标记技术。
实验原理
带有地高辛标记的dUTP（图1）通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛，进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应，使探针上带有AP等分钟，进一步能催化化学或发光反应。图2为各种DIG标记探针及检测类型汇总；图3为DIG标记探针的方法；图5为标记探针应用；图4为DIG标记探针的检测方法。
图1
图2
图3
图4
图5
实验步骤
1. 1ug(10ng <DNA探针量<3ug)待标记DNA溶于16ul水中，在沸水浴10分钟变性，迅速放于冰浴（NaCl或乙醇冰浴）冷却。
2. 在冰浴上，上述管中加入4ulDIG－HIGH－Prime混合物（含5×反应缓冲液、50％甘油、各1mM的dATP，dCTP，dGTP，0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG－dUTP ，1U/ulKlenow酶）。
3. 离心混合，3760分钟或过夜
4. 加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min终止反应。
5. 在上述20/22ul反应体系中加入2.5ul4MliCl，75ul(-20℃预冷)乙醇沉淀，70%乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于少量PH8.0TE中，－20℃保存（忌讳反复冻融）。
附 件 (共5个附件,占128KB)
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