优化色谱质谱参数获得理想的单抗轻重链分子质量(二)
图 1. Q-Exactive 质谱采集的单抗轻链原始质谱图(SID 代表源内碎裂能量,右上角的数字代表峰强度)
图 2. Q-Exactive 质谱采集的单抗重链原始质谱图(SID 代表源内碎裂能量,右上角的数字代表峰强度)
3.2 液相色谱梯度的优化
在样品初步测试的过程中,我们使用 10 分钟的色谱梯度进行样品测试,得到的 LC-MS 色谱质谱图如图 3 所示,可以看到轻重链在同一个色谱峰中出峰,没有实现完全的分离,不过从质谱图中可以看到,色谱峰的前半部分为轻链,后半部分为重链,可以实现轻重链的分子质量测定。在不考虑时间限制的情况下,可以适当的延长色谱梯度,实现轻重链的完全分离,如图 4 所示,轻重链的色谱洗脱梯度主要在乙腈相 20%–50%,延长该段时间到 5 分钟,延长总色谱梯度时间到 15 分钟,就可以实现轻重链的完全分离。
图 3. Q-Exactive 质谱采集的 10 分钟色谱梯度的单抗轻重链色谱质谱图
图4 Q-Exactive质谱采集的15分钟色谱梯度的单抗轻重链色谱质谱图
3.3 完整和脱糖 Herceptin 的轻重链分子量测定
基于以上的色谱和质谱条件优化,以 SID 为 30 eV 和色谱时间为 15 min,完整和脱糖 Herceptin 的轻链 LC-MS 以及原始质谱图如图 5 所示,相应的去卷积质谱镜像图如图 6 所示,可以看到轻链的平均分子质量为 23438 Da;相应的重链 LC-MS 以及原始质谱图如图 7 所示,相应的去卷积质谱镜像图如图 8 所示,可以看到脱糖重链的平均分子质量为 49149 Da,完整 Herceptin 的糖型主要存在形式为 2G0F 和 G0F+G1F。
图 5. Q-Exactive 质谱采集的 15 分钟色谱梯度的完整和脱糖 Herceptin 的轻链色谱质谱图
图 6. Q-Exactive 质谱采集的 15 分钟色谱梯度的完整和脱糖 Herceptin 的轻链去卷积分子质量镜像图
图 7. Q-Exactive 质谱采集的 15 分钟色谱梯度的完整和脱糖 Herceptin 的重链色谱质谱图
图 8. Q-Exactive 质谱采集的 15 分钟色谱梯度的完整和脱糖 Herceptin 的重链去卷积分子质量镜像图
4. 结论
本文基于 Q-Exactive plus 质谱平台,主要优化了源内碎裂能量(SID)这一质谱参数和色谱洗脱梯度,从而实现了单抗轻重链有效的色谱分离和高信噪比的质谱测定,为药物开发、生产和质检过程中的单抗轻重链分析提供了直接的实验方法,同时相似的质谱参数也可以应用到其它基于 Orbitrap 类型的质谱仪器上,为广大的生物制药客户提供了单抗样品轻重链快速分析的参考依据。