逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段
一、实验原理
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
二、实验试剂
Taq酶，M-MLV逆转录酶，dNTPs， DEPC处理水，双蒸水，大肠杆菌总RNA
三、实验 仪器
电泳仪， PCR仪，高速离心机，移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪
四、操作步骤
1．cDNA的合成：
逆转录体系的组成：
2．PCR扩增特异性片段
（1）25ul PCR体系的组成：
| 组分 体积 |
| 10×PCR Buffer 2.5μL dNTPs (2.5mM，each) 2μL Sense primer 1μL Antisense primer 1μL cDNA 1μL DEPC处理水 17 μL Taq 酶 0.5μL |
五、实验注意事项
整个操作始终注意避免RNA酶的污染；
PCR反应灵敏，注意避免 试剂 污染；
酶易失活，整个操作注意在冰上进行。
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