Northern Blotting 实验操作指南
实验概要
本文介绍了Northern Blotting实验详细操作流程。
实验材料
1. 试剂盒提供
NorthernMax (Formaldehyde-Based System for Northern Blots)[Catlog#1940]
6ml -20℃ Formaldehyde Load Dye
225ml 4℃ ULTRAhyb
80ml 4℃ 10×Denaturing Gel Buffer
600ml 4℃ 10×MOPS Gel Running Buffer
8g RT Agarose-LE
1000ml RT Transfer Buffer
450ml RT Low Stringency Wash Solution#1
450ml RT High Stringency Wash Solution#2
250ml RT RNaseZap
1ml AT Nuclease-free Water
注：1) RT：室温；AT：任何温度
2) 如果试剂中有沉淀出现，属于正常情况，请于37℃水浴溶解，并摇匀。
3) 一般情况下，试剂盒中的试剂保质期为6个月，如果温度控制合适，RNaseZap能够保质一年。
2. 自备
1) 普通用品
a．Nuclease-free water (用于溶解琼脂糖，稀释 running buffer到合适的工作浓度)
在双蒸去离子水中加入DEPC，使终浓度达到0.1%，(例如，1L双蒸去离子水中加入1mlDEPC)；反复摇晃均匀，于37℃－42℃温度条件下孵育数小时或过夜也可；高温高压灭菌至少45min，这样DEPC的气味应该可以完全除去或大部分除去。
b. 聚丙烯小离心管，1.5ml或0.65ml规格。
c. 移液枪，各种规格的枪头。
d. 一次性手套
e. 杂交膜（例如：Whatman 3MM）
f. 刮胡刀，解剖刀片或剪刀
g. EB（Ethidium bromide）
h. 塑料包装袋
i. 纸巾
j. 搪瓷托盘
k. 吸水纸
l. 切纸刀
m. 尺子
n. 铅笔
2) RNA 电泳装置
a. 水平电泳槽，相应的梳子，制胶盘
b．电泳仪
3) 转印与杂交的试验材料
a．尼龙膜（推荐使用Ambion公司的BrightStar-Plus membranes, 可以最大限度的降低背景的影响，还可以增强杂交信号。）
b．杂交管和杂交炉
c．密封袋
d．紫外灯（用于RNA的交联）
4．探针
实验步骤
1. 探针的制备
1) 根据相应序列设计用作探针，尽量长一些，50bp以上。
2) 稀释探针使其最终浓度达到50ng/μL，稀释液用标记试剂盒中的TE buffer，（公式为摩尔数×分子量/50）。
3) 在开始标记前准备一块新的96孔板，放置于冰上。
4) 将要标记的探针放在PCR仪上，100℃变性15min（10μL/PCR管）。
5) 变性结束后迅速将探针放置于冰水浴中。
6) 在预冷的96孔板中加入变性好的探针，再于每孔中加入1μL的生物素标记物（BrightStarStar Psoralen-Biotin，使用前先将Psoralen-Biotin溶解在33μL Dimethyformamide中）。
7) 混匀，365nm紫外灯下直接照射45min，样品和灯源的距离不能超过2cm。
8) 以上步骤6、7必须在暗室中操作，紫外灯照射后用89μL的TE溶液稀释到100μL。
9) 稀释好的探针用200μL的饱和丁醇抽提两次，7,000rpm离心，弃上层丁醇（尽量吸干净）。
10) 标记好的探针-80℃冻存。
2. 制胶和点样：
1) 称取1.5克琼脂粉加入135mL0.1%的DEPC水。
2) 在微波炉中加热溶解，开始时胶温度很高，取1mL封住胶槽的两边，用手按住挡板，直至其凝固，待剩余的胶温度下降后，加入15mL 10×Denauring Gel Buffer(试剂盒中有)，混匀，然后将胶全部加到胶槽中，胶厚度为0.8-1cm。
3) 样品的处理：取20μL细胞总RNA加入45μL的Formaldehyde Load Dye（试剂盒中有），再于其中加入2μL的EB，混匀后PCR仪上65℃变性15min。然后立即放入冰浴中，冰浴时间不定，放入要迅速，冰浴的时间可长可短，什么时候有时间，什么时候取出来。）
4) 准备变性的电泳液，10×MOPS Gel Running Buffer稀释到使用浓度（70mL的10×MOPS Gel Running Buffer，在其中加入630mL的0.1%的DEPC水），共700mL的电泳缓冲液）。
5) 胶凝固（凝固后要测量胶的尺寸）后开始上样，使用相同探针的几个样品要在一起跑，相同的样品做一个重复，要同时设阳性对照和阴性对照。（胶凝固后，在外面把挡板和梳子拔出）
6) 加样后开始电泳，50V 8小时。（直接将电泳制胶槽放在电泳槽中跑电泳即可，电泳仪时间要设好，以防止人不在的时候电泳自动停止）
3. 转印：
1) 先将胶取出（直接把制胶盘一块取出，带上RNase Zap，纸巾，于RNase Zap处理的成像仪上拍照，拍完后小心的将胶移上电泳制胶板，注意不要让胶滑出，将胶转移放置在一张保鲜膜上，取胶时将保鲜膜拉至桌边，边移动边扯保鲜膜），倒出电泳液（顺便可以冲洗一下胶），胶需要用Transfer Buffer 清洗一下。
2) 取出BrightStar-Plustm Membranes 将其切割成与胶等大的膜（前面电泳时已量好，可再量），切5张滤纸和一张滤纸桥，同时将所需要的纸塔（吸水纸）切好，3cm厚。（在取胶之前做好）
3) 切好的膜放在0.1%的DEPC水中浸泡。（用一个搪瓷托盘，放置入0.1%的DEPC水，将切好的膜先放入其中）
4) 把制胶盘放入电泳槽中，再在电泳槽中将滤纸桥放到里面（可以是30cm），加入Transfer Buffer 湿润后再放两张与膜等大的滤纸（一定要排除气泡，用制胶的挡板排除气泡），胶放到滤纸上要正面朝上，膜放在胶上，再加三张滤纸在膜上，最后将草纸放在滤纸上，加重物（可用电泳槽的盖子，500g即可）在上面，封好电泳槽（用保鲜膜封，只要左右边缘抵住草纸，防止Transfer Buffer自然挥发，转印过夜。（在放置各层时一定要排除气泡）
4. 杂交：
1) 转印过夜后带好刀，尺子，铅笔，RNaseZap，卷纸，切出样品条带，拍照，并做好标记。
2) 开始杂交，首先将ULTRAhyb杂交液在杂交管中68℃预热，5mL/50cm2。
3) 取下重物，并且将转印好的膜和胶分别在紫外灯下成像看转印效率，分别在膜上标记。
4) 将标记好的膜放到预热的ULTRAhyb杂交液中，42℃预杂交30min，探针分别是欧洲株和北美株的3’端序列。
5) 用1mL已预热的ULTRAhyb杂交液稀释10μL探针。
6) 将稀释好的探针加到杂交管中，42℃杂交过夜。
5. 洗涤和显色成像
1) 洗涤液时要用20mL/100cm2，所有的洗涤液要37℃溶解后使用。
2) 用low stringency washing在室温洗涤5min，连续洗涤两次，在杂交炉仪。
3) 用High stringency washing在42℃洗涤15min，连续洗涤两次，在杂交炉仪。
4) 膜在Wash Buffer中洗涤5min，连续两次。
5) 将膜在Blocking Buffer中孵育5min，连续两次。
6) 膜在Blocking Buffer中孵育30min。
7) 用10mL Blocking Buffer稀释1uLStrep-AP，用该稀释溶液将膜在杂交管中孵育30min。
8) 将膜在Blocking Buffer中孵育10min。
9) 用Wash Buffer将膜洗涤5min，连续洗涤3次。
10) 用1×Assay Buffer将膜洗涤2min，连续洗涤两次，0.5mL Assay Buffer/cm2。
11) 用CDP－Star将膜孵育5min，5mL/ cm2。。
12) 在一张滤纸上去除残留的CDP-Star，不能让膜完全的干了。
13) 将膜密封在杂交袋内，暗室中操作将膜放在X-光胶片上成像。
14) 曝光后的第二天开始洗相片。
