简并寡核苷酸诱变实验
小段DNA序列中产生大量突变
| 实验材料 | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | DNA聚合酶 dNTP 甘油 NaCl EDTA SDS 无水乙醇 |
| 仪器、耗材 | 水浴锅 离心机 分光光度计 |
| 实验步骤 |
1. 设计寡核苷酸，其3‘端含有由8个核苷酸组成的回文结构，且包含某一限制性内切酶的识别位点；如果可能的话，5’端也应有一含某个限制性内切酶位点的序列。中间区段则应含目的诱变区。
2. 寡核苷酸的合成。在无需突变的位置时，用一种核苷酸前体的同质溶液进行合成，而在需要突变的位置时，则用特定的核苷酸前体混合物来控制合成反应的进行。
3. 通过HPLC和（或）含7 mol/l 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化每核苷酸，用水调整浓度至1 mg/ml。
5. 加1 μl 10×DNA聚合酶1缓冲液，降温至适合3‘端回文结构杂交的温度，保温不少于60 min。
7. 加1 μl 0.5 mol/l EDTA终止反应，加TE缓冲液至总体积为50 μl，加乙酸钠至终浓度为0.3
mol/l。用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀DNA。DNA重悬于20 μl TE缓冲液。取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析之用。
8. 在30 μl 反应体积内，每微克塞核苷联用10~40 U 的识别外侧限制性酶切位点的酶消化双链寡核苷酸2 h 以上，如寡核苷酸5’端无限制性内切酶位点，则用识别内侧限制性内切酶位点的酶切割。
9. 取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，余下的用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀，在重悬于不少于10 μl 的TE缓冲液，然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
10. 切下双链DNA所在的胶，并用凝胶洗脱缓冲液将其洗脱出来，用20 μl 的TE缓冲液重悬，贮存于-20℃。
展开 |
