寡核苷酸介导的诱变实验
实验材料 大肠杆菌
试剂、试剂盒 PEGTEATP寡核苷酸诱变引物T4多核苷酸激酶EDTASSC
仪器、耗材 水浴锅电泳仪培养箱
实验步骤
1. 将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含有1 ml 灭菌TY培养基的1.5 ml 微量离心管中，60℃温育5 min，以杀灭细菌细胞，剧烈振荡以释放琼脂中的噬菌体，离心2 min。
2. 将100 μl 上清转移至1 L 的烧瓶，瓶中装有100 ml 培养基，其中含0.25 μg/ml 的尿苷。
3. 加5 ml 处于对数生长中期的大肠杆菌培养液，于37℃剧烈 振摇培养6~18 h。
4. 以5 000 g 离心30 min，保留上清。
5. 确定噬菌体在ung-大肠杆菌对ung+大肠杆菌中的相对滴度。
4. 毎4体枳的上清加1体积的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，混匀，0℃温育1 h。
6. 5 000 g 离心15 min，倒弃上清，在15 ml Corex管内用5 ml TE缓冲液溶解沉淀，在旋涡混合器上剧烈振荡。
7. 将噬菌体溶液置冰上1 h，如上步再次离心以去除细胞碎片，再用酚抽提和乙醇沉淀单链噬菌体DNA，通过测260 nm 吸光值确定DNA浓度。
8. 在1.5 ml 微量离心管内加入下列试剂：
（1）20 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液
（2）2 μl 10 mmol/l ATP
（3）突变的寡核苷酸（长15~20个核苷酸〉
（4）加水至20 μl
（5）2 U T4多核苷酸激酶
（6）37℃温育60 min，加3 μl 100 mmol/l EDTA并加热至70℃终止反应。
9. 加含尿嘧啶的单链环状DNA模扳（通常为1 μg DNA溶解在1 μl 体积）至磷酸化的寡核苷酸中，加1.25 μl 20×SSC，充分混匀，离心5 s。
10. 将离心管放入一个盛有70 ℃水的500 ml 烧杯中，自然冷却至室温后离心5 s，置于冰上。
11. 加入下列试剂以形成杂交混合液：
（1）20 μl 5×聚合酶混合物
（2）2.5 U或T4 DNA聚合酶
（3）2 U T4 DNA连接酶
（4）加水至100 μl
（5）充分混匀，然后置于0℃5 min，室温5 min，37℃2 h。
（6）最后加3 μl 500 mmol/l EDTA终止反应。
12. 取20 μl 在0.8%的琼脂糖上电泳。对照泳道应包括单链环状病毒DNA，双链闭环DNA和带切口的双链坏状DNA。
13. 根据电泳结 果估算DNA的量，用1~100 ng的双链DNA产物转化ung+大肠杆菌。
14. 选择性地或随机挑取所得克隆（噬斑或菌落）用以分离纯的克隆原种。
15. 通过DNA序列测定对选出的克隆进行分析。
