寡核苷酸介导的诱变实验
基本方案
实验材料 | 大肠杆菌 |
---|---|
试剂、试剂盒 | PEG TE ATP 寡核苷酸诱变引物 T4多核苷酸激酶 EDTA SSC |
仪器、耗材 | 水浴锅 电泳仪 培养箱 |
实验步骤 |
1. 将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含有1 ml 灭菌TY培养基的1.5 ml 微量离心管中,60℃温育5 min,以杀灭细菌细胞,剧烈振荡以释放琼脂中的噬菌体,离心2 min。
2. 将100 μl 上清转移至1 L 的烧瓶,瓶中装有100 ml 培养基,其中含0.25 μg/ml 的尿苷。
4. 毎4体枳的上清加1体积的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体,混匀,0℃温育1 h。
8. 在1.5 ml 微量离心管内加入下列试剂:
9. 加含尿嘧啶的单链环状DNA模扳(通常为1 μg DNA溶解在1 μl 体积)至磷酸化的寡核苷酸中,加1.25 μl 20×SSC,充分混匀,离心5 s。
12. 取20 μl 在0.8%的琼脂糖上电泳。对照泳道应包括单链环状病毒DNA,双链闭环DNA和带切口的双链坏状DNA。
展开 |