酶免疫分析技术进展与自动化
郝繁运 综述
中国误诊学杂志 2007年 第一期
第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编
摘要：本文主要介绍了酶免疫分析的发展现状，从酶免疫分析标记技术若干环节的技术进步、在方法学上与现代化技术的融合与发展、酶免疫分析技术在仪器自动化方面的进展与现状以及酶免技术的局限等方面进行了论述，特别对当今酶免疫分析自动化仪器常见类型的原理及特点进行了简明扼要的介绍。
关键词：酶免疫分析 进展 自动化
酶免疫分析（Enzyme Immunoassay,EIA）是标记免疫分析中的一项重要技术,是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。作为经典的三大标记技术之一,酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新，不断和其他先进技术如荧光、发光技术以及仪器自动化相融合，日臻完善,许多自动化仪器实际上是EIA技术和其他现代化技术的复合体，其分析敏感度已达到甚至大大超过放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因试剂稳定无放射性污染且分析形式日趋多样化，简易灵活，临床应用广泛而倍受重视。
1、酶免疫分析的技术进步
近年来，EIA技术取得了显著的发展，主要表现在以下方面：
1.1.继单克隆抗体后的第三代抗体基因工程抗体的应用，明显地提高了检测的特异性，基本消除了抗原、抗体间的非特异性交叉反应，保证了分析的准确性。抗体制备技术的进步，使试剂的生产制备得以规模化，检测范围日益扩展，小分子抗原、半抗原的检测成为事实 [1] 。
1.2.分析方式的改进与多样化提高了试验的敏感性。
1.2.1.除早期的竞争法，间接法外，又发展了双抗原夹心法测抗体，偶联酶标记法测抗原，桥联酶免疫分析，酶放大免疫分析技术等，后者应用了生物素-亲和素系统，底物循环放大系统，酶-抗酶放大系统及酶偶联放大系统等。[2]
1.2.2.由于酶标记技术的进步，标记酶的应用已从过氧化物酶，扩展到碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脱氢酶，葡萄糖氧化酶，苹果酸脱氢酶，至今有二十多种酶被应用于EIA ，但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP） 和碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。
1.2.3. 酶免疫分析与其它标记免疫分析相结合如与荧光免疫分析（Fluorescence Immunoassay ,FIA）结合形成荧光酶免疫分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay ，FEIA），酶促放大时间分辨荧光免疫分析（Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA与化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）结合形成酶—化学发光免疫分析，增强化学发光酶免疫分析（ECLEIA）。EIA与聚合酶链反应结合形成的PCR-EIA分析等[3,4,5]。
1.2.4.改进固相载体的技术
传统ELISA应用的固相载体是聚苯乙稀微孔板，聚苯乙烯珠或条，后发展为硝酸纤维素膜、活化滤纸、硅片、尼龙、利用高分子材料合成的各种固相微粒等。为提高固相表面的结合容量，增加结合物的范围而改造聚苯乙烯的表面，如用化学偶联法导入功能性醛基、酰基、烷胺基等以更好地与蛋白质，多肽的羧基结合，用位点导向性共价偶联法引入亲和素，蛋白A，多聚赖氨酸等，以牢固地捕获蛋白或多肽，超平整聚苯乙烯表面的制备，克服了表面粗糙带来的不均一性，达到平均粗糙度只有2A+的超平整平面，实现了对蛋白的结合容量大，脱附率低，孔间均一性好，使试验精密度达5%。应用于双抗体夹心法时，聚苯乙烯经射线照射后，可以增加其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能。近年美国Corning公司研制成功表面经琥珀酰亚胺酯活化酶标板，其质量达到氨基活化相似水平 [6] 。
1.2.5.分析方法的创新 如同步ELISA法测定多种抗体是将抗原包被在与微孔相匹配的钉板的钉子上，盖上钉板的同时与微孔内的所需标本、试剂反应，是又一种改良ELISA。利用抗体和抗抗体能形成多层复合物的特性，将常规二步温育法改为一步温育测定法，使检测时间大为缩短，现在已广为应用[3]。
2. 酶免疫分析在方法学上与现代化技术的融合发展[4,6]
酶免疫测定具有高度敏感性、特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，更由于现代生物学技术的发展，抗原抗体制备和酶标记技术的完善，特别是商品试剂盒的标准化和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶免疫测定不断与现代化技术的融合中得到发展。
2.1斑点-ELISA 斑点-ELISA的原理与ELISA的区别在于用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜代替塑料制品作为固相载体，酶作用底物后在硝酸纤维素膜上形成有色沉淀而使膜着色。它的灵敏度较一般ELISA高6～8倍、可达ng水平，试剂用量小，不需其它设备条件。
2.2免疫印迹法 免疫印迹法是将电泳与ELISA结合起来的一种方法，分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段。免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法。
2.3发光酶免疫测定 发光酶免疫测定与一般EIA的区别是酶所催化的底物是发光剂。产物不是一般EIA的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。常用HRP和AP作为标记酶与其发光底物作用进行分析。
2.4增强发光酶免疫分析 增强发光酶免疫分析(enhaned luminescene enzyme immunoassay, ELEIA)是EIA技术的新发展。其特点是酶促增强发光信号，并稳定和延长发光信号时间。既保持发光免疫分析的高灵敏度，又克服了传统发光酶免疫分析所发信号时间短的缺点，目前国外已实现自动化分析。
2.5 BAS-酶联免疫吸附试验 BAS-酶联免疫吸附试验是将生物素-亲和素（BAS）放大系统与ELISA结合起来的一种技术。生物素（B）有两个环状结构，其中一个可以和亲和素结合，另一个可以和包括酶、抗原（抗体）的多种物质结合。亲和素（A）有4个可与生物素稳定结合的亚基，此为放大系统的关键，即有1个亲和素就能结合4个生物素，亲和素也可被酶标记。
在BAS的应用中正是利用了生物素和亲和素的这些特点，设计了两类反应类型：一类是以游离亲和素为“桥”，分别连接生物素化抗原抗体反应系统和酶标生物素。此种类型有BAB法和ABC法，另一类是直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统，此种类型有BA法。这种通过BAS放大作用可将更多的酶聚集在固相载体上，使酶免疫技术检测的灵敏度进一步得到提高。
2.6 酶促荧光放大免疫分析技术（Fluorescence Enzyme Immunoassay, FEIA）原理是利用具有潜在荧光的底物作为酶标物催化放大的显示系统，由于累积放大和荧光的高敏感性，使方法学的灵敏度提高很多。
2.7酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRFIA）其突出特点是引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除特异荧光的干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。
3. 酶免疫分析技术的自动化 [8,9,10,11,12] 20世纪50年代生化自动分析仪就取得实际应用。由于酶免疫测定技术上的特殊性，直到20世纪80年代后才有自动化分析系统问世，目前我国全自动酶标仪市场基本上被进口品牌独占天下。按分析过程的不同，酶免疫测定可分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两大类。
3.1 均相酶免疫测定及其自动化 均相酶免疫测定也称非固相或液相免疫测定，用于小分子物质特别是药物浓度的测定。模式为竞争法，即标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，然后进行标记物的测定。在特定的情况下，与抗体结合的标记物失去其特性，因此不需将结合的（B）和游离的（F）分离即可直接测定F中标记物的量。
1972年Syva公司开发的酶扩大免疫测定技术（Enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）和1992年Microgenics公司开发的克隆酶供体免疫测定（Clone enzyme donor immunoassay，CEDIA）均属均相酶免疫测定，这两种方法的试剂在生化自动分析仪即可进行标本的检测。因而专用于EMIT和CEDIA的全自动分析仪较少。
3.2 异相免疫测定及其自动化
大部分标记免疫测定均属异相。最常用的B和F的分离手段为固相载体的洗涤，但在临床化学测定中无此步骤。70年代初，Engvall和Perlaman等学者首次创建非均相酶免疫测定技术，也称固相酶免疫测定即酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay），通用的名称为ELISA，在ELISA中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等类型。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置。因此异相免疫测定的自动化不能借助于生化自动分析仪，各种方法均有其特殊的自动分析系统，下面作几方面介绍。
3.2.1 微孔板式自动分析仪
不同厂家生产的板式ELISA试剂种类繁多，但均采用规格统一的8×12的96孔微板。因此仪器厂生产的板式ELISA自动分析仪均为"开放式"的，即适用于各家的试剂产品。微孔板每一孔的彻底清洗是ELISA的关键，亦是自动分析的难点。因此直至近年才有全自动的板式酶免分析仪问世。Bio-Rad公司的CODA自动酶免疫分析仪以及更为智能化的EVOLIS酶免分析仪、Dynex公司的DSX、DIAS、Dias Ultrs全自动酶标分析系统均可同时进行多块微板的全自动测定。Bio-Tek公司的Fastrack智能型酶标板处理系统可与宝特系列读板机、洗板机和液体处理系统联合使用。Tecan公司的大型全自动酶免一体机--瑞士TECAN，为全自动平台，双机械臂同时工作，全部过程无须人工干预，全自动微板处理系统RMP（Robotic Microplate Processor），能够完成从标本分配到最后结果的全部过程，适合于中大规模具有多种实验项目的实验室。经过几年的发展许多板式酶免分析仪已经具备真正意义上的全自动分析处理无人职守系统。Microlab F.A.M.E全自动酶免处理系统是瑞士HAMILTON公司生产的一套完全自动化的酶标处理系统,它可以执行ELISA试验中所有必需的处理步骤,同时该仪器也是一套开放系统,可同时处理各个厂商的不同ELISA试验项目,具有操作灵活简便,处理能力大及日常维护方便等特点，是目前比较不错的一套系统。
3.2.2.其他形式固相载体的自动分析仪
微孔板以外的固相载体形式，其自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。
管式载体的特点是小管可同时作反应和比色的容器。如Boehringer Mannheim公司开发的ES300型分析仪、ES600型全自动EIA分析仪属此种类型，但自该公司并入Roche公司以后，各型ES仪器已停止生产。
Abbott公司最早采用0.6cm直径的小珠作为载体，小珠放在相应大小的塑料孔盘中滚动冲洗，属半自动类型。Roche公司的COBAS COREⅡ自动分析仪则采用粒径较小的小珠为固相载体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体，以TMB为显色底物，可检测40多个项目，为全自动的分析系统。
Abbott公司应用胶乳微粒作为载体的MEIA（微粒子酶免疫测定）自动分析系统较小珠型更为先进，胶乳微粒可吸附在玻璃纤维膜上进行洗涤。这种自动分析系统称为IMx，现在与TDx合并组成全能型的Axsym系统。
磁性微粒表面积大，可用磁铁吸引进行分离，是较为理想的载体。瑞士Serono公司的SEROZYME型酶免疫分析仪属此类型。这种载体已被其他标记免疫测定所采用。
4. 酶免疫分析技术和其他分析技术在自动化仪器中的联合应用 [13]
4.1 化学发光酶免疫测定
这是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。Amersham公司早期开发了以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性的化学发光酶免疫测定系统AMERLITE，经Johnson & Johnson 公司改良后商品名为VITROS Eci全自动任选式增强化学发光免疫分析系统，此仪器将酶免疫技术，生物素亲合素技术和增强化学发光技术相结合。以辣根过氧化物酶标记抗原或抗体，以塑料小孔管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂。关键技术是应用了发光增强剂，使发光强度增加千倍，时间延长且稳定。美国贝克曼库尔特公司(Becman Coulter)的Access全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统,该系统是由美国贝克曼公司和法国巴斯德研究院合作设计生产的。该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体、以磁性微粒子为固相载体,用AMPPD(Diomums)作为化学发光剂,这种化学发光剂发光稳定、持续时间长,因此比闪烁发光容易控制。类似的分析系统有Diagnostic Production Corporation 公司的IMMULITE2000型，全自动任选式酶标记抗原或抗体，以AMPPD（Dioxeten）作为发光物，以塑料珠为固相载体。测定原理与贝克曼公司的Access基本相同。
4.2 酶促荧光放大免疫分析技术
法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统，系统采用双抗夹心法以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用塑料吸管(SPR)为固相载体,以4-甲基伞型酮磷酸盐(4-MIjP)为发光剂、美国Nexct公司的Aura Flex采用磁珠法和标记酶直接催化发光底物发光（AKP标记，4-MUP为底物）。
4.3 酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRFIA）美国MD公司(Molecular Devices Corporation)的微孔板式荧光酶标仪SPECTRAmax®GEMINI XS，是首家应用双单色光连续波长系统于微孔盘，荧光、冷光和时间分辨荧光三合一的机型。能从事终点测读、动力学测读、光谱扫描和细胞计数实验，采取多项设计，降低激发光反射的干扰，微孔盘塑料、样品组成物和溶剂（包括水）本身含有的萤光物干扰。
4.4 微粒子酶免疫分析技术（Microparticle enzyme immunoassay,MEIA） 方法科学、试剂仪器稳定、灵敏度高、定量线性范围宽等优点，如美国Abbott公司IMX全自动免疫荧光分析仪，反应最终形成微粒上包被的抗体- 被测物-碱性磷酸酶标记的二抗夹心复合物，将其转移到玻璃纤维柱上用缓冲液洗涤, 再加入底物进行测定，有配套试剂供应。Abbott公司的AXSYM全自动快速免疫分析系统，该系统综合使用了微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)、荧光偏振免疫分析技术(F凹的,可测定激素、肿瘤标志物、肝炎、病毒标志物、维生素和各种治疗药物浓度等)。
5. 酶免疫分析的局限性
5.1 酶免疫分析检测的特异性实际上决定于单克隆抗体所针对的抗原决定簇。因而受试剂中包被所用抗原抗体的纯度、特异性，酶标记物的稳定性、特异性、纯度、亲和力以及制备工艺等诸多因素的影响，故对检测试剂盒应严格比较和选定。固然，其他标记免疫分析方法也有此类问题，但EIA试剂盒的供应厂商数量最多，应予注意。
5.2 在酶免疫分析测定结果中目前所测的胰岛素或C肽，近年发现是该物质及其前体的混合物就是受抗体局限的明显例子，是由于有交叉的抗原性而难以分开，因此通常检测的只能称为“免疫反应性”胰岛素或C肽，这使得我们需重新评价过去对所测的胰岛素或C肽的认识，并致力于“真”或“纯”胰岛素、C肽的测定，类似的情况可能还会发现。
5.3 酶免疫分析以固相反应为主，在测定中要注意克服固相不同部位包被抗原（抗体）量不一致引起的表面效应，温育时要防止边缘孔与中心孔反应条件不一致引起的边缘效应，以及抗原、抗体间比例不匹配可能引起的钩状效应，必须引起注意的是操作简易的“一步法”常比“二步法”易发生钩状效应。
5.4 固相材料存在非特异性吸附，标本溶血或冰箱贮存可释放过氧化物酶，冰箱贮存时间过长可导致血清IgG聚合，均容易引起本底偏高，甚至严重干扰测定。需要指出的是随着技术进步和仪器自动化程度越来越高，这些缺陷在自动化程度较高的仪器和工作量较大的实验室中已不十分明显，但在半自动化仪器和标本量少需冰箱贮存时，这些缺陷还是显而易见的。总之，随着科学发展和技术创新，酶免疫分析技术必将越来越完善，自动化程度越来越高，准确度和精密度越来越好，定将为人类的健康事业作出更大的贡献。
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【后记】：2006年，该篇综述论文参加了中华医学会举办的“第五次全国中青年检验医学学术会议”，在《汇编》中刊登后收到多家杂志的录 用通知。有的是本人投稿，有的是看到《汇编》后约稿的。先后被《中国误诊学杂志》、《临床和实验医学杂志》、《医学综述》、《国际检验医学》、《齐鲁医学检验》......
