双杂交和其他双成分系统实验（三）
方法
转化文库
1. 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，30°C 摇动过夜培养。
重要：应该在用文库重新转化之前 7~10d 内，将诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子质粒转化到酵母中。在整个试验过程中始终保持无菌条件非常重要。
2. 稀释 20 ml 的过夜培养物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，以使稀释后培养液的 OD600 约为 0.10~0.15。在旋转摇床上 30°C 摇动培养，直到该培养物增殖 1~5 倍，OD600 达到 0.50 左右。
3. 把培养物转移至 1 个 250 ml 的无菌离心瓶中，室温下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心 5 min。移去上清，加入 30 ml 无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。
4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心酵母细胞 5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸锂的 TE(pH7.5) 中。
5. 在 30 个 1.5 ml 的无菌小离心管中分别加入 1ug 的文库 DNA 和 50ug 刚刚变性的载体 DNA。马上在每个小离心管中加入 50ul 的酵母悬浮液（来自步骤 4)。
—个成功的转化试验，每微克文库 DNA 应该产生约 105 个转化子。使用小体积的 DNA(最好毎个转化管中少于 10ul) 通常可以提高转化效率。
平行地进行多份小量的酵母转化有利于喊少污染的概率，而且这种方法与在较少试管中采用较大体积相比，经常可以得到显著更髙的转化效率。每份感受态酵母细胞悬泮液中不要加入过多的转化文库 DNA, 否则每个感受态细胞可能吸收多个文库质粒，使后面的分析复杂化。
6. 在每管细胞悬浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸锂的无菌 TE(PH7.5), 轻轻翻转试管若干次使混合（不要振荡)，30°C 培养 30~60 min。
7. 每个试管中加入 40ul DMSO, 翻转混匀悬浮液，在 42°C 的加热块上加热 10min。
8. 按照下述步骤将转化混合物铺平板：
其中的 28 管只用于产生转化子
a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上。
b. 将细胞涂匀，并将平板置于 30°C 孵育直到菌落出现。
每个 24 cmX24 cm 平板需要 250~300 ml 的培养基，应该在倒制平板后室溫干燥 1~2d 再使用。为了减少污染的机会，倒制平板后需用火烘烤平板表面。一些研究人员采取了另外的处理方法：打开平板，翻转盖子放置在标准组织培养超净台内，紫外线照射约 10 min。
剩余 2 管用来评价转化效率
a. 从每个管中取 350ul 混合物加却 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平扳上。
b. 铺平细胞，30°C 培养平板直到菌落出现。
c. 吸取每管中剩余的 40ul 混合物用无菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1:10 稀释（至少 3 次)。
d. 每份稀释液吸取 100ul 铺在 100 mmCM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 培养平板直到菌落出现。
分析稀释度能够大致估计所得转化子的数目。100 mm 指示平扳上预测增加的转化子菌落数目偶尔与 24 cmX24 cm 平板上的数目有显著的不同，尤其是不同批次的平扳之间。一个成功的转化实验中每个大平板上应该产生 20000~40000 个菌落。
初级转化子的收获和富集
步骤 9~14 提供代表全套初级转化子的冻存物，可用于后面的筛选。在这个实验中，从初级转化子（约 106 个细胞）制备同质的细胞悬液，每一份都可以用来在选择培养基上进行平板筛选。这项技术代表了更加常规的转移酵母的方法（例如：复制平板培养），它转移了如此大量的细胞，以至于在选择培养基上可以观察到某种程度上导致虚假背景的细胞生长。如果在平板上观察到可见的霉菌斑或其他的污染，那么在收获文库转化子之前，用无菌刀片小心地切去污染物及其周围部分。
在步骤 9 中，第一种方法（揺动法）操作起来很快，可以在同一天进行文库的诱导和选择培养基上的筛选，它也缩短了平板打开的时间，从而避免源于空气传播的霉菌和细菌的污染。大约三分之一的酵母细胞悬浮液将留在平板上；然而正常情况下所使用的量不超过收集悬液的 2%，所以保证酵母菌落以大致相等的概率从平板上洗脱是很重要的。步骤 9 中的第二种方法（刮擦法）节省试剂，而且可以方便地在已经切掉霉菌和污染物的平板上使用。
9. 使用下列方法之一收获文库。
1) 通过摇动法收获文库
a. 分别在 5 个含有转化子的 24 cmX24 cm 平板上倒入 10 ml 无菌水和大约 30 粒无菌玻璃珠。
b. 把 5 个平板叠放在一起，紧握平板，猛烈地摇动平板直至菌落重新悬浮（1~2 min)
c. 用无菌移液管从每个平板中吸取 5 ml 酵母悬液（倾斜平板) 把细胞悬液集中在 50 ml 的无菌锥形管中。
d. 继续下面的 5 个平板，重复步骤 a~c。连续从 30 个平板中收获酵母细胞，结果得到总体积为 150 ml 的酵母悬液，保存在 3 个 50 ml 管中。
相同的玻璃珠可以转移到新的平板中，也可使用新的玻璃珠。同时洗脱的平板可以超过 5 个，只要手可以握住摇动即可。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后，弃去残余的琼脂，冲洗平板，用乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射 10 min, 存储备用。
2) 通过刮擦法收获文库
a. 戴着手套，把 30 个含有转化体的 24 cmX24 cm 平板放在 4°C 环境中使琼脂变硬（通常需要 2 h 甚至过夜）。
b. 把一个显微镜载玻片在乙醇中浸泡，然后灼烧消毒，用这个玻片轻轻地把酵母细胞从转化平板上刮至 50 ml 的锥形管中。不断地重新灼烧玻片或换用新的玻片（每 5~10 个平板)。
全部 30 个平板上的细胞通常汇集在一或两个 50 ml 锥形管中。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后弃去残余的琼脂，冲洗平板，乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射 10 min，存储备用。
10. 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌 TE(pH7.5) 或无菌水至 40~45 ml, 振荡或翻转试管悬浮细胞。
11. 使用台式离心机 1000~1500 g(使用 Sorvall H1000B 转子 2200~2700r/min) 室温下离心试管 5 min, 弃去上清。
12. 重复步骤 10 和 11。
第二轮洗涤后，源自 1.5X106 个转化体的细胞沉淀总体积应为 25 ml。
13. 重新悬浮紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。
14. 分别转移1ml 的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70°C 冻存（至少 1 年内细胞保持稳定）。
如果直接在选择培养基上进行平板培养（完成需要 5 h)，留一份不要冻存，进行下面的步骤。假设未冻存培养物的存活力 100%,—般情况下，酵母冻存时间少于一年，预期存活力将大于 90%。如果出现意外情况（例如：特别是在选择培养基上铺平板培养冻存细胞后没有得到菌落)，通过在 CM(GlU)-Trp-His-Ura 上进行一系列的有限稀释测量冻存细胞的存活力。
相互作用蛋白的筛选
转化文库的每一份铺在亮氨酸缺乏的选择培养基上来检测其能否促进 LEU2 转录。并不是所有含有相互作用蛋白质的细胞在亮氨酸缺乏的选择性培养基平板上都以 100% 的效率生长（Estojaketal.1995)。为了增加检测到相互作用的概率，转化文库中获得的每一个克隆都应该在选择培养平板上出现 3~10 个能存活的酵母细胞。例如：最初得到 5x105 个克隆，1.5x106~5x106 个细胞就应该涂布在 2~5 块平板上。虽然这样操作可能导致过多地分离到相同的 cDNA, 但是它帮助我们保证了所有的初级转化子在选择培养基平板上至少呈现 1 个细胞。事实上，在一批相对较少的阳性克隆中，一条相同的 cDNA 的重复分离可被看作为一个特殊蛋白质间相互作用的标志。
15. 解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤 14)， 用 CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp 培养基按 1:10 稀释，30°C 摇动培养酵母细胞 4 h 来诱导文库中 GAL1 启动子的转录。
16. 在适当数量的 100 mm CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp-Leu dropout 平板上分别培养 106 个细胞（或 50ul OD600 为 1.0 的培养物）。
重要：每个平板 105 个细胞为通常有效使用的最髙平板密度。更髙密度平板培养（例如：3X106。可能产生酵母细胞间的共栖现象，导致很高的背景生长。
17.30°C 培养平板 5d。
决定于所使用的单个诱饵蛋白，好的阳性相互作用单元候选菌通常在 5d 内长出克隆，大多数克隆在 4d 间出现。
18. 观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。
一个好的策略（特别每生长出大量克隆时）是每天现察平板，并不需要马上挑取克隆。而是第一天肉眼可以看到的充隆用实验室记号笔以一个特定顔色的点在平板上标记它们的位置（例如：第 3 天为红色）。每一天以不同的颜色笔标记刚刚长出的克隆（第 4 天为蓝色等）。
19. 第五天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板 (CM[Glu]-Ura-His-Trp)。如果出现许多明显的阳性克隆，就有必要按照第二天、第三天和第四天出现的克隆分别生成一些单个的平板。为了为后面的步骤制作一个阴性对照，从检测酵母细胞存活力的平板上随机挑取 3~5 个克隆（请参见步骤 14 的说明），在测试主板上平行划线培养。如果在后面的实验步骤中使用多支管/蛙形器，要确信在合适的方格网中划线以保证菌落与蛙形器上的辐条相对应（请参见图 18-10)。
20.30°C 孵育平板直到斑点/菌落形成。
阳性相互作用的初次确定：β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测步骤 21 和 22 检测 lexAop-LEU2 和 lexAop-lacZ 报道基因的半乳糖诱导的转录活化。两个报道甚因在半乳糖特异诱导的条件下同时表达，表明这种转录表型的出现是因为文库编码蛋白质的表达，而不是酵母宿主菌的突变。含有葡萄糖和亮氨酸的母板可用来提供检测克隆。
