双杂交和其他双成分系统实验（四）
21. 测定转录活化。
这个实验可以利用牙签重新划线培养或利用多支管/蛙形器来进行，在分析大量阳性克隆时，多支管/蛙形器是非常有用的（有关蛙形器的详细情况请参见图 18-10)。
1) 通过直接划线培养测定
a. 使用一个平头牙签分别在下面的 4 个平板上复制和主板上相同的栅格。使用相同的牙签在四个平板上划线培养单克隆，尽量在含有 X-gal 平板上划制粗的酵母线条，而在亮氨酸缺乏的平板上划制细的酵母线条。
CM(Glu/X-gal)-Ura-His-Trp 1 个平板
CM(Glu/Raff/X-gal)-Ura-His-Trp 1 个平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 个平板
CM(Glu/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 个平板
b. 平板在 30°C 培养 3~4d。
X-gal 平板在 48 h 之内即会产生结果，最强的相互作用甚至 18 h 就会长出斑点。48 h 到 72 h 之间亮氨酸平板上不同的生长状况通常很明显。
2) 使用多支管/蛙形器测定
a. 在 96 孔微量滴定板上的 48 个孔中加入 25~30ul 无菌水。
b. 使用蛙形器从预先画好栅格的主板上将菌斑同时转移至微暈滴定板的孔中。轻轻摇动滴定板。
c. 再次使用蛙形器从微量滴定板中将酵母转移至下面的平板上。这种方法可以把大致相同数量的细胞转移到同一块平板上。
CM(Glu)-Ura-His-Trp 2 个平板
CM(Gal)-Ura-His-Trp 1 个平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 个平板
CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 个平板
d. 平板在 30°C 培养 3~4d。平板在培养 1d 后，采用氯仿覆盖法（请参见第一阶段结束处的替代方案：“通过氯仿覆盖分析屮半乳糖苷酶活性”)，使用一个 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板和一个 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板测定 lacZ 报道基因的活化。
e. 继续监控菌斑的生长：通常在 48 h 到 72 h 之间，在亮氨酸平板上的生长与在亮氨酸缺乏平板上的生长将产生明显的不同。第二块 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板可作为新的主板。
22. 解释结果。如果具备下面的条件，菌落和它们包含的质粒被认作为第一轮的阳性充隆：
(1) 在 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板上的培养物 X-gal 分析呈现蓝色。
(2) 在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上的培养物 X-gal 分析呈现白色或仅是浅蓝色。
(3) 菌落在 CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生长良好。
(4) 菌落在 CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生长缓慢或根本不能生长。
第三阶段 阳性相互作用的再次确定
材料
缓冲液和溶液
乙酸铵（7.5 ml/L)
氯仿
乙醇
异丙醇
裂解液
酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救缓冲液中或β-葡糖醛酸酶 100000 单位/ml(Sigma）按 1:50 稀释于拯救缓冲液中每次使用均需配置新鲜的溶液。
酚（早衡至 pH8.0)
拯救缓冲液
50 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/LEDTA
0.3%β-巯基乙醇
每次使用均需配置新鲜的溶液。
SDS(10%,m/V)
STES 裂解液
100 mmol/LNaCl
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS
TE(pH8.0)
酶和缓冲液
限制性内切核酸酶 Eco RI，XtoⅠ，Hae Ⅲ
凝胶
琼脂糖凝胶
请参见步骤 5。
培养基
CM 选择培养基
利用表 18-3 估计所需培养基的量，并根据表 18-9 制备所需的选择培养基。
无氨基酸的酵母氮源（YNB) 分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表 18-9 中假定 YNB 中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它就不含有硫酸铵，配制时毎升培养基中应加入 5 g 硫酸铵。
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板
细菌基本培养基（色氨酸缺乏）
制备下列高压灭菌贮存液：
1.20%(m/V）硫酸镁
2.4 mg/ml 尿嘧啶
3.4 mg/ml 组氨睃
4.4 mg/ml 亮氨酸
5.20%(m/V) 葡萄糖
制备下列过滤除菌溶液：
6.50 mg/ml 苄青霉素
7.1% 盐酸硫胺素
分别高压灭菌下列两种溶液：
8.15 g 琼脂溶解于 800 ml 蒸馏水中
9.10.5 g 磷酸氢二钾
4.5 g 磷酸二氢钾
1 g 硫酸铵
0.5 g 柠檬酸钠
160 ml 蒸馏水
将溶液 8 和 9 冷却至 50°C，混合。迅速加入 1 ml 的溶液 1.10 ml 的溶液 2，10 ml 的溶液 3，10 ml 的溶液 4,10 ml 的溶液 5,lml 的溶液 6，以及 0.5 ml 的溶液 7。彻底混合终溶液，马上倒制平板。
酵母选择 X-gal 培养基
i. 按照表 18-9 所述，在 900 ml 水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至 55°C
ii. 在另外一个瓶子中，7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠溶于 100 ml 蒸馏水中, 高压灭菌。
iii. 把两种高压灭菌溶液混合在一起，加入浓度为 100 mg/ml 的 X-gal 溶液（溶于 N,N-二甲基甲酰胺）0.8 ml, 倒制平板。
