范可尼贫血（先天性骨髓发育不全）的诊断——二...（二）
支持方案 2 用于染色体断裂分析的吉姆萨染色
吉姆萨染色是一种组织学染色，对细胞核和染色体有特别的亲和力。制作简单，使未显带的细胞核和染色体成微红色到紫色。
1.将一片 pH6.8 的 Gurrs 缓冲液溶于 1L 水中。
2.加入 4 ml 新鲜的吉姆萨染液至盛有 46 mlGunrs 缓冲液的染缸中。染液可使用 1h 或染 20 块玻片，然后就要配置新的染液。
3.将中期染色体玻片染色 5 min。在盛有 Gurrs 缓冲液的染缸中浸洗几次（第 1 步)。
4.在盛有水的染缸中浸洗几次。空气中干燥，检查玻片的染色强度。
染色强度应该足量，而染色体上的裂痕和断裂区又不易染色（非染色）。
5.使用 Permount 组织封固剂将盖玻片加载于载玻片上。
备选方案 1 成纤维细胞培养二氧桥丁烷试验
如果外周血不能获取，可以通过皮肤组织活检成纤维细胞培养来进行试验。也可以从流产儿或死产儿中取几小片肺组织或皮肤来进行试验。因为较高浓度对 FA 成纤维细胞有太大的毒性，很难收获足够多的中期分裂相来进行研究。
1.将 0.5 ml DMEM 完全培养基/20% FBS 溶液中的活体组织放于一块 60 mm 组织培养皿上，并用无菌手术刀将其切割成片，1 mm 大小。
2.另取最少三块 60 mm 组织培养皿，用无菌手术刀尖在皿底划上几条水平线和垂直线。滴几滴 DMEM 完全培养基/20% FBS 溶液至活体组织片上。在每个 60 mm 组织培养皿上用无菌 Pasteur 移液管放上 5 或 6 片活体组织。将组织放在水平线和垂直线的交叉点上。
3.孵化培养皿，不要加任何其他组织培养基，15~30 min，使组织片黏附在皿上。加 5 mlDMEM 完全培养基/20% FBS 溶液至每块培养皿中，孵化培养基。
4.每 3~4d 更换一次培养基，但不要扰乱组织片。使用倒置显微镜观察培养基中细胞的生长状况（得花上 1 周至 1 月才能观察到生长较好的细胞）。
5.当培养皿中的组织片周围能看到大片的成纤维细胞时，用 1X 胰岛素/EDTA/15% FBS 处理细胞，进行传代（附录 31)，注意当活体组织能够继续在培养基中生长时不要将它们取出来。将细胞转移至盛有 DMEM 完全培养基/15%FBS 的 25 cm2 无菌组织培养瓶内。
6.当第一代细胞长满后，再次用胰蛋白酶处理（附录幻）。次代培养按1：3 分装至 DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液中。为 FA 患者进行 DEB 试验时，至少有两个第二代培养基中长满细胞。
7.用 5 ml DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液将细胞接种在 25 cm2 培养瓶中，使每个培养瓶中细胞的密度达到 3X105 个细胞（为本次检验准备两个处理的和未处理的对照培养瓶）。孵化 24 h。
8.将 DEB 按以前所描述的那样稀释（基本方案，第 2~3 步），再增加第 4 管，分装 PBS 4.5 ml。成纤维细胞培养还要增加最后一步稀释，即从第 3 管中取出 0.5 ml(500ul 加入第 4 管中。
9.从第 4 管取出 254 加入到 10ml 新鲜的 DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液中。
10.培养细胞直至细胞接近长满（约 72 h)。
11.胰酶消化细胞（附录 31) 按 1:2 或 1:3 传代到新鲜的完全 DMEM/15%FBS 培养基。该培养基不含 DEB 用于收集充足的有丝分裂细胞来进行细胞遗传研究。重新加入限制性培养基，该培养基含有鲜好、稀释的 DEB。
12.于第一个有丝分裂时段收集培养的细胞（传代 24~48 h; 这时细胞处于有丝分裂中期附近），在收集细胞前 3 h，加入 1ml 浓度为 1ug/ml 的秋水仙胺到 DEB 处理的细胞中，同时用未用 DEB 处理的细胞作对照（于 5 ml 培养基）。
13.用胰酶消化细胞，将培养瓶内的液体转移至 15 ml 无菌的离心管，加盖，150 g 离心 10min。
14.去掉大部分上清，使剩余上清内的沉淀重新悬浮，并慢慢加入 0.051mol/L 的 KCl 5 ml。在 37°C 水浴箱中孵化 lOmin。离心 lOmin。
15.像前面叙述的那样将细胞固定在预备好的载玻片上（基本方案，第 9~12 步；在第 9 步，缓慢加人 3~5 ml 固定液)。
16.检验 100 个未处理和 DEB 处理后吉姆萨染色的中期分裂相细胞，找断裂染色体，方法如前所述（基本方案，第 13 步，支持方案 2)。根据在 FA 患者成纤维细胞中为基线和 DEB 诱导的染色体断裂所建立的评估来解释结果。
备选方案 2 范可尼贫血二氧桥丁烷产前诊断试验
FA 可以在妊娠时诊断，但有一定风险，在怀孕 9~12 周时通过培养绒毛绒膜取样 (chorionic villus sampling,CVS) 获得滋养层细胞或者在 15~17 周时羊膜穿刺获得羊水细胞进行研究。FA 也可以用胎儿血液进行产前诊断，方法与以前的外周血培养相同。
研究 CVS 或羊膜穿刺获得的胎儿细胞
1.在 25 cm2 的培养瓶内配置胎儿细胞培养基（单元 8.1 和单元 8.2)。
2.当培养瓶内有几个大的、生长迅速的克隆时，不要让克隆过度的生长，用胰酶消化细胞，按 1:2 或 1:3 进行首次传代培养（附录 31)。孵化 24 h。
3.用自有 0.01 ug/ml DEB 的新鲜生长培养基置换生长培养基（从两个不同的首次传代培养基中）至最少两个培养瓶中。可能的话，用含0.1ug/ml DEB 的培养基置换首次传代的培养基至另外两个培养瓶中，稀释与以前相同（备选方案丨，第 8~9 步)。
剩余培养瓶中的液体作为染色体断裂研究基线的未处理对照。
4.孵化培养基，收获并固定细胞，如之前叙述的那样准备中期染色体涂片（备选方案 1，从第 10 步开始)。
5.每组共检测 100 个中期分裂相（基线组，DEB 处理组；每组分别从两个首次传代培养瓶中各取 50 个中期分裂相）。根据针对通过 CVS 或羊膜穿刺获得的 FA 胎儿细胞所制定的基线和 DEB 诱导的染色体断裂所建立起来的评估来解释结果。
