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真菌/酵母细胞高纯线粒体分离试剂盒使用说明

2020.4.18

主要用途

真菌/酵母细胞高纯线粒体分离试剂是一种旨在使用生物、化学和物理方法相结合，有效去除真菌/酵母菌细胞壁，进一步快速且充分裂解真菌/酵母菌细胞，从而分离出完整而高度纯化的活性线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜培养或冻存的野生型或突变型真菌/酵母菌菌株细胞的活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品最佳。

技术背景

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。

产品内容

清理液（Reagent A）        250毫升
平衡液（Reagent B）   250毫升
酶解液（Reagent C）   500微升
裂解液（Reagent D）         40毫升
净化液（Reagent E）    10毫升
强化液（Reagent F）     5毫升
保存液（Reagent G）   100毫升
活性液（Reagent H）   200微升
高纯液（Reagent I）    55毫升
产品说明书     1份

保存方式

保存酶解液（Reagent C）、净化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，严格避免污染；高纯液（Reagent I），避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于细胞收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
恒温水槽：用于孵育反应物
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）冻融，然后移出20微升活性液（Reagent H）和1毫升净化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

准备好50毫升新鲜真菌/酵母菌样品
在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷细胞/毫升；总量为5 X 10⁸细胞）
转移到预冷的50毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入25毫升清理液（Reagent A），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入2毫升平衡液（Reagent B），混匀
加入50微升酶解液（Reagent C），混匀
放进30℃恒温水槽孵育60分钟，期间每隔15分钟轻轻用手摇匀
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进30℃恒温水槽孵育30分钟，继续实验步骤21
同时将平衡液（Reagent B）置入冰槽里预冷30分钟（注意：以下步骤在4℃环境下进行）
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升预冷的平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升含有裂解液（Reagent D）、净化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）的裂解工作液
涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
选择下列其中一种方法：

方法一：物理处理法

即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20下）（注意：参见注意事项10）
将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
加入500微升保存液（Reagent G），充分混匀沉淀颗粒
放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
移取5.5毫升的高纯液（Reagent I）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent I)）
轻轻加入500微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent I）的上面，避免震动
放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
小心抽去线粒体样品带以上的液体
小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
加入1至2毫升保存液（Reagent G）
放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液
（选择步骤）重复实验步骤16至18一次
加入500微升保存液（Reagent G），混匀
即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
放进－70℃冰箱里保存

方法二：化学处理法

在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
加入500微升预冷的强化液（Reagent F）
涡旋震荡5秒，充分混匀
在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）
加入5毫升预冷的保存液（Reagent G），轻轻摇动试管混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
加入500微升保存液（Reagent G），充分混匀沉淀颗粒
放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
移取5.5毫升的高纯液（Reagent I）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent I)）
轻轻加入500微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent I）的上面，避免震动
放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
小心抽去线粒体样品带以上的液体
小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
加入1至2毫升保存液（Reagent G）
放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液

（选择步骤）重复实验步骤18至20一次
加入500微升保存液（Reagent G），混匀
即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
放进－70℃冰箱里保存

注意事项

本产品为10次操作（50毫升菌液：1克细胞湿重或5 X 10⁸细胞）
其它实际操作的细胞量与试剂使用量按比例调整：例如10毫升菌液（OD600=1）：试剂用量是标准用量的五分之一
操作时，须戴手套
操作时，避免污染母液
50毫升（OD600＝1）菌液湿重约1克
细胞生长条件影响线粒体的质量：建议在有氧条件下富含葡萄糖的培养基培养
实验步骤20以下的所有操作均须在4℃或以下状态下进行
建议使用足够的细胞量
建议严格控制操作时间
通常匀化次数为20下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
通常1克细胞湿重或5 X 10⁸细胞的线粒体含量为50微克线粒体蛋白，但不同菌株或培养条件会存在差异；建议使用纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒（YJ10059）测定线粒体蛋白浓度
建议使用40000g以上离心速度；如果没有条件，则不能低于30000g，离心时间增加为60至90分钟

14．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
15．本产品所获得的线粒体纯度（可达到99％）和产量最为理想
16．使用高纯液（Reagent I）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
17．根据超速离心管的大小调整高纯液（Reagent I）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
18．制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融