Vero 细胞在 WAVE 反应器中的微载体球转球放大（一）
Vero 细胞在 WAVE 反应器中的微载体球转球放大
陆丽芳，Christain Kaisermayer, 姚钰舜，隋礼丽
通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，上海
概要
Vero 细胞能被广泛应用于疫苗的生产。Vero 细胞的培养技术能否成功放大对于该技术能否大规模应用于疫苗生产至关重要。作为贴壁细胞，我们的经验证明Vero 细胞能够成功地用微载体技术在 WAVE 反应器中生长。为了进一步寻求放大培养的可能性，我们在 WAVE 反应器中进行了细胞从微载体 Cytodex 1 上的球转球实验。一系列的实验都相当成功。Vero细胞首先在 10 L的培养袋中用Cytodex 1微载体培养到一定密度，生长在微载体上的细胞随后用胰蛋白酶消化，经消化后基本脱离微载体的细胞最终和旧的微载体根据一定的传代密度转移到新的微载体培养体系中并开始新一轮细胞培养。我们的结果显示，几次这样的转移传代前后，细胞的生长速度基本一致。Vero 细胞的微载体培养技术在 WAVE 反应器中放大完全可能。进一步的实验显示，在现有的工作条件下，Vero细胞在 Cytodex 上的培养以及球转球工艺可以达到 10 倍的放大倍率。这为基于细胞培养的疫苗大规模工业化生产新前景提供了可靠的支持。
前言
Vero细胞最初起源于非洲绿猴肾，已知对多种病毒如 SV40、 SV-5、 麻疹病毒、虫媒病毒、呼吸道肠道病毒、风疹、猿腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。Vero 细胞因而被广泛应用于针对相应疾病的疫苗开发[1]。最近针对流感疫苗的开发就使用到了 Vero 细胞[2]。知名的制药企业百特公司（Baxter Healthcare)成功利用 Cytodex3 型微载体进行 Vero 细胞流感疫苗的生产，使用 3 级不同的发酵罐进行微载体球转球扩增，最终至 6000L 反应器的培养规模。诺华公司也早已在其欧洲的细胞培养工厂中得到许可使用细胞疫苗生产技术。诺华公司最近与美国卫生与公共服务部（HHS)达成协议，后者赞助前者 4.86 亿美元在北卡罗来那建立哺乳动物细胞疫苗生产基地，计划 2012 年投入使用[3]。细胞疫苗技术，具有快速和可靠的特征，作为全球发展的大趋势，将有望逐步替代目前的鸡胚疫苗技术。
作为贴壁细胞，Vero 细胞需要生长于一定的表面，在小规模状态下可以用 T 型培养瓶或滚瓶来进行培养。国内微载体细胞培养水平和国外差距较大，多数仍使用转瓶/细胞工厂直接接种到 30L 发酵罐中，采用多个 30L 发酵罐平行放大操作。转瓶培养属于劳动密集型操作，无法对 pH、溶氧等参数进行精密控制，同时具有较高的污染风险。多个小型发酵罐的平行放大无法避免每个反应器之间的差异，增加了生产过程的控制点，不利于产品质量的稳定性和整个生产工艺的验证，限制了产能。
因此需要开发大规模微载体细胞培养技术以满足生物技术发展的需要，而微载体球转球放大工艺就是其中的关键点之一[4,5]，以便在更大的工业规模进行培养和生产。衡量这一技术是否成功, 一方面固然是转移是否成功，同样重要的另一方面则是转移后细胞是否能有同样的生长状态。
方法
WAVETM 反应器中 Vero 细胞的培养
在10升的细胞培养袋中，Vero在微载体 Cytodex 1 (Cyt.1)上贴壁培养，微载体浓度是 3-6g/L,悬浮培养体积 1.5-3L。在接种前一天，细胞培养袋预先被放置到WAVETM 反应器上，充满 10% CO2,并加入 70-90%培养体积所需的培养液以及微载体，并在 37°C 摇动过夜以便使温度和 pH 得到充分平衡。接种当天，用胰酶把细胞从细胞工厂中消化下来，重新悬浮于新鲜的培养基中并转移到预先平衡的细胞培养袋中，细胞接种密度控制在每毫升 3-5x105个细胞。培养条件是，摇速 11 rpm，角度 4 度，温度 37°C。pH 控制在 7.0-7.3 之间。根据葡萄糖的代谢情况适时通过用新鲜培养液替换培养袋内的培养液来补充营养。每天采样监测细胞生长速度和状态。
细胞计数的方法是，用含柠檬酸的结晶紫染色液破碎细胞，释放并染色细胞核，通过在显微镜下计数细胞核来确定细胞的数量。微载体上的细胞形态则通过固定，苏木素染色和显微镜来观察并照相。细胞密度达到约每毫升2-3x106个时，进行球转球实验。每次球转球实验后，细胞在WAVETM 反应器内用上述同样的方法进行数天的培养，观察生长状况。
