Vero 细胞在 WAVE 反应器中的微载体球转球放大（四）
B2B #5 采用第二种方式进行高倍率放大。用 3g/L 的微载体密度培养 Vero 细胞至细胞密度 3.07x106/毫升,培养体积为 3 升。用胰酶把 Vero 细胞从微载体上消化下来。取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到新的 1.5 升的培养体积中，微载体浓度为 6g/L。待细胞密度达到 5x106/毫升以上时，补充新鲜培养基至培养体积 3升。这样培养体积及微载体表面积的放大倍数均是十倍，最终微载体浓度为3g/L。而在培养初期，细胞密度和微载体密度均得到提高，从而提高了微载体和细胞的接触机率，理论上有利于细胞贴附到微载体上并能更好地生长。作为平行比较试验，取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到另一个细胞培养袋中，培养体积 3升，微载体浓度 3g/L。两个培养同时进行，观察细胞生长的情况。
图 7.球转球实验 B2B #5前后细胞生长曲线
图 7 显示的是上述球转球实验 B2B #5 前后的细胞生长曲线。由于其中一个在培养过程中有培养体积的变化，这里的纵坐标采用细胞总数。球转球前后细胞生长速度基本一致。球转球以后细胞仍然保持旺盛的生长活力。同样有意思的是，球转球后采用较小的培养体积培养，从而使单位体积内细胞密度和微载体密度提高，细胞和微载体接触机率提高，这样的方法并没有显著地提高细胞的生长速率。这表明细胞在稍低的接种密度下也能很好的生长起来，并不需要用降低起始培养体积的方法来提高接种密度。
图8.球转球实验B2B #5前后 Vero细胞在微载体上的生长情况
图 8 显示的是上述球转球实验 B2B #5 前后 Vero 细胞在微载体上的生长情况。因球转球之后培养中细胞起始密度较低，培养时间延长了两天。也因此，除了相应于种子培养的在第一、三、六天的细胞形态外，我们这里也列出了球转球后培养了九天后细胞在微载体上的形态照片。球转球后细胞贴附和生长情况良好。我们也看到分别用 1.5 L 和 3 L 的起始密度培养细胞最初的贴附情况，贴附数量，以及后面的细胞生长情况基本没有差异。这也提示了提高单位体积内细胞密度和微载体密度，从而提高细胞和微载体接触机率的方法并没有带来太大的好处。
讨论
在这一部分的工作中，我们做了 Vero 细胞从微载体上的球转球实验，细胞培养在 WAVETM 反应器内进行，球转球实验在瓶子内或 WAVETM 培养袋内进行。实验结果显示球转球实验相当成功，Vero 细胞的微载体培养在 WAVETM 反应器内放大是可行的。
我们分别尝试了在瓶子中（B2B #1）和在 WAVETM 培养袋中（B2B #2 和 B2B #3)进行球转球实验。在实验室小规模情况下，在瓶子中进行球转球实验相比在细胞培养袋中进行有一定的优势。前者操作起来比较容易。在一个透明的瓶子中，沉降后的微载体更容易被清晰地看到，所以能更多地去除上清。这样微载体能得到更有效的清洗。另外瓶子也可以用水浴来保持恒温，如果不太大的话可以较剧烈地摇动。这样细胞能更有效地脱离微载体。然而，如果考虑到大规模的培养，球转球实验需要在 WAVETM 培养袋内进行，因为这样就有一个全封闭的系统来更好地操作较大的体积。从WAVETM 培养袋中进行球转球实验（B2B #2和B2B #3) 得到的结果来看，这种方法效果也很不错，只是需要较多的 PBS来洗涤，胰酶的用量也稍多。
胰酶消化较长时间能够更好地使细胞和微载体完全分离。但消化太长时间也会降低细胞活力并影响细胞重新贴壁的效果。因此胰酶消化的时间最好能控制在40 分钟之内。消化过程中，除消化时间外，酶用量、反应温度、微载体和酶之间充分的混合是保证不同微载体上细胞同步消化的重要因素，从而有效避免酶的局部过量和潜在的细胞损伤。
