Vero 细胞在 WAVE 反应器中的微载体球转球放大（二）
在瓶子内进行球转球实验
在 WAVETM 反应器内细胞密度达到需要的水平时，Vero 细胞微载体培养悬浮液即被转移到另外一个透明的瓶子中并移到生物安全柜中。后面的清洗和胰酶消化过程等均在生物安全柜内进行。在微载体沉降下来之后，去除上清。剩下的微载体被转移到 500 毫升无菌透明的瓶子内（这是根据 2 升培养体积所需的瓶子大小，不同的情况应有不同的需求）。尽量多地去除上清。加入 400 毫升 37°C 预热的含 0.02% EDTA 磷酸缓冲液 (PBS-EDTA), 适当混合，待微载体沉降后去除上清。以上同样的过程重复 3次以使微载体得到充分洗涤。
长有细胞的微载体在用 PBS-EDTA 充分洗涤之后，即用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶消化。2 升的培养体积（6 克微载体），胰酶用量为 300 毫升。胰酶预先在37°C 预热，在与微载体混合之后置于 37°C 中并每隔 10 分钟进行一次充分的混合。25-30 分钟之后，根据所需要的接种密度和稀释倍数，取一部分细胞-微载体-胰酶混合悬浮液到一个干净的无菌转移瓶内，与新鲜培养基混合并接种到一个新的培养袋中开始新一轮的培养。在 WAVETM 培养袋内进行球转球实验
在 WAVETM 反应器内细胞密度达到需要的水平时，球转球实验在 WAVETM 培养袋内进行。实验开始前，准备装有 5-10 升 PBS-EDTA 的液体转移瓶和溶积 5-10 升的废液瓶，灭菌。准备 1 升的液体转移瓶两个，灭菌，并在无菌条件下分别装入胰酶和新鲜培养基。将 PBS-EDTA，胰酶和新鲜培养基分别预热至 37°C。
在无菌条件下（如无菌管道焊接机）将这几个瓶子与细胞培养袋接通。整个实验过程中细胞培养袋均被置于反应器上。反应器停止摇动并停止加热以防过热或不均匀加热。培养袋内长有 Vero 细胞的微载体会在数分钟内沉到底部。用泵把尽量多的上清液移至废液瓶。加入一定量的 PBS-EDTA，轻柔混匀后，再次沉降微载体并移去上清。如此重复三次，每次使用 PBS-EDTA 的量不超过一个培养体积。
长有细胞的微载体在用 PBS-EDTA 充分洗涤之后，与 37°C 预热的含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶混合，在微载体密度为 3g/L 时，胰酶的用量为 15%培养体积。胰酶的用量可根据实际情况作调整。加入胰酶后的混合液每 10 分钟轻柔摇动混合一次。25-30 分钟后，细胞培养袋内的悬浮液被转移至一个空的无菌转移瓶内。用少量新鲜培养液淋洗培养袋一次并和前面的合并。根据所需要的接种密度和稀释倍数，接种新的细胞培养袋并开始新一轮培养。
结果
在细胞培养袋中和外部瓶子中进行的球转球实验结果比较
这里有三次球转球实验（B2B #1, #2, #3)。其中一次球转球实验(B2B #1)在培养袋外的瓶子中进行，另两次(B2B #2 和#3)在 WAVETM 培养袋内进行。第一次（B2B #1)和第三次(B2B #3)实验的 Vero 细胞来自通过细胞工厂接种到培养袋中并生长起来的细胞，而第二次实验 (B2B #2)的 Vero 则直接来自第一次球转球实验后接种并培养起来的细胞。这几次实验我们均是在细胞密度超过 2x106时进行球转球，并把
放大倍数控制在 5-6 倍。表 1 列举的是这三次转移的大致情形。在第一次转移之前，细胞首先从细胞工厂接种到 10 升的培养袋内并培养生长到所需要的细胞密度。经过球转球之后的细胞培养也是在 10升的培养袋内进行。
表1.各次球转球实验情况
每次球转球前后的细胞生长情况都通过每天采样来监测。图 1 和图 2 显示的就是根据每次培养每天细胞密度的增长情况绘制的细胞生长曲线。我们把相关联的放在一起做比较。其中图 1 显示的是 B2B #1、B2B #2 之前和之后细胞生长曲线，而图 2 则显示的 B2B #3 之前及之后的细胞生长情况。我们可以看到在各次球转球实验前后，细胞都保持着良好的生长活力。在球转球实验之后，因起始细胞密度相比初始种子培养的稍低，因此需要多一天时间达到相似的细胞密度。总体来说，细胞生长的速度基本相同。
图1.球转球实验B2B #1和 B2B #2前后细胞生长曲线
图2.球转球实验B2B #3前后细胞生长曲线
