恒温核酸扩增反应引物探针设计问题合集
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司开发）。以此为基础的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
酶促重组等温扩增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA），由苏州先达基因科技有限公司独立自主开发，拥有全球自主知识产权，在低温条件下(25-42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度35-40℃时，扩增反应时间仅需15分钟，以此达到核酸快速检测的目的。该技术同样对硬件设备的要求很低，现已应用于研究诊断、公共卫生、食品安全、水产畜牧等各个领域。
RPA和ERA的扩增引物可以说是整个反应的关键所在，那么怎样才能设计好其引物呢？
1、RPA引物需要多长？
RPA引物一般在32至35个核苷酸之间。某些情况可能用到少于30个核苷酸的引物，但扩增过程会显著减缓。
ERA 引物需要多长？
为了充分利用 ERA 的检测速度和灵敏度，我们建议客户使用 29-32 个核苷酸长 度的引物。通常情况下，PCR 引物可用于 ERA 反应体系，但这类引物的检测速 度和灵敏度可能不及较长的引物。
2、RPA引物应当相距多远？
这取决于你的具体应用。标准试剂盒适用于不超过500bp的扩增产物。RPA扩增产物的大小是没有下限的，不过RPA引物一般需要扩增子超过80bp。扩增产物在100-200bp之间，可以实现最快的RPA扩增。
ERA 引物应当相距多远？
一般而言，我们建议两个 ERA 引物产生的扩增片段不应超过 300bp。ERA扩增片段的大小或许没有下限，不过根据 ERA 引物最小长度，扩增片段的大小最小 约 80bp。为了获得最快的检测速度，最终的扩增片段长度应为 100-200bp。
3、RPA 我需要筛选多少引物？
这取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说，如果目标分子上千，那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话，最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时候，候选引物可以有10到20对。测试的引物越多，找到好引物的几率也就越大。
ERA 我需要筛选多少引物？
这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说，如果您只需要每个反应检测 1000 个分子或以上，那么大多数引物对都够用了。对于极高灵敏度的检测，最好是进 行系统性的引物筛选以找到好的 ERA 引物。最初筛选时，测试的引物条数通常 是正反向引物各 7 条。测试的引物越多，找到能够检测单个分子的好引物对的几率就越大。
荧光型ERA产品探针设计
探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。
荧光团与淬灭团只能标记在胸腺嘧啶（T）上，且荧光团与淬灭团间距在2-5个碱基。
THF为替换位于荧光团与淬灭团之间的某碱基，且dT-荧光团或 dT-淬灭团与 THF 之间的核苷酸数量可以是 0、1 或 2。
探针的3’端需加上阻断基团
试纸型ERA产品探针设计
探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于THF位点的 5’端，另外至少15个位于其 3’端。
THF为替换位于荧光团下游30bp后与阻断基团上游15bp之间的某碱基
荧光团只能标记在胸腺嘧啶（T）上。
探针的3’端需加上阻断基团
反应需要用多少引物？
基础反应每次需要480nM引物，有时，稍微改动一下引物的用量可以提高其性能。对不同引物浓度进行测试（从200nM 到600nM）将有助于找到最合适的引物浓度。
反应需要用多少探针？
反应一般每次需要120nM探针。不过，略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内（从50nM到150nM），根据自己的具体应用对探针进行优化。
现成的PCR引物能用吗？
RPA多半不行。绝大多数PCR引物不能用于RPA。
而通常情况下，PCR 引物可用于 ERA 反应体系，但这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。
现成的PCR探针能用吗？
不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合RPA或者ERA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性完全不兼容。
筛选引物的时候必须用探针么？
不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。
引物筛选时应该用什么样的条件？
引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件，例如模板的拷贝数、样本纯度等等。
给定引物的性能还能再提高么？
一般来说，稍微改动一下引物的序列可以提高其性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化：以单核苷酸为基础略微改变引物的长度；或者保持引物长度不变，以1bp为基础移动引物的位置。经过了改动的引物，需要重新进行扩增活性的测试。
RPA引物的熔解温度应该是多少？
RPA和ERA反应是在常温下进行的，DNA的解链与PCR有很大不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。
引物需要特别纯化么？
在进行引物筛选的时候，一般不需要纯化。在其他情况下，引物的质量会造成批次间的差异。如果对一致性要求比较严格，最好先纯化引物再进行RPA或者ERA反应。
使用引物和探针的时候还需要注意些什么？
引物和探针需要同时添加到体系中，一先一后会使片段重组出现偏向性。
我该如何选择探针？
如果使用适用于探针的其中一种试剂盒，需要注意的是，在标靶区域选择探针位置时，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可帮助您设计备选检测 方案。
我如何配制冻干引物、探针？
通常，用 TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）来制备 100μM 的储存溶液， 并长期储存于-20℃。
