维生素E对慢性间断性缺氧大鼠学习记忆的作用
摘要:目的 探讨不同剂量维生素E(Vitamin E , Vit E) 对慢性间断性缺氧(chronic episodic hypoxia , EHYP) 大鼠学习记忆能力和脑内胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase , ChAT) 活性的影响。方法 建立EHYP大鼠模型,并给予大(50IUP250g体重Pd) 、小(5IUP250g体重Pd) 剂量Vit E干预。用被动避暗回避反射试验评价大鼠学习记忆能力,潜伏期(STL) 越长,学习记忆能力越强;用放射化学法测定大鼠皮层、海马和纹状体ChAT活性。结果 EHYP处理后,与对照组相比, EHYP 组大鼠STL明显缩短( P< 0. 01) ,各脑区ChAT活性均显著降低( P < 0. 05) 。药物干预后,与EHYP组相比,Vit E大、小剂量组大鼠STL均显著延长(Vit E大剂量组: P< 0. 05 ,Vit E小剂量组: P < 0. 01) ,但大剂量组大鼠STL明显短于小剂量组( P < 0. 05) ;就ChAT活性而言,小剂量组大鼠各脑区ChAT活性均显著升高( P < 0. 05) ,而大剂量组大鼠仅海马和纹状体ChAT活性显著升高( P < 0. 05) 。结论 Vit E可改善EHYP大鼠学习记忆能力并提高其脑内ChAT活性,且小剂量优于大剂量。
关键词:缺氧;被动避暗回避反射试验;胆碱乙酰转移酶;维生素E阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep ap2nea syndrome , OSAS)可引起学习记忆障碍已成为不争的事实,大量研究显示,慢性间断性缺氧(chronic epi2
sodic hypoxia , EHYP)在其中发挥了重要作用。目前,有关OSAS的治疗方法较多,但至今尚未找到有效方法预防和改善OSAS所致的学习记忆障碍。维生素E(Vitamin E , Vit E)是一种脂溶性维生素,有文献报道它通过其抗氧化特性可改善AD及衰老所致的认知障
碍。我们通过建立能反映OSAS部分特征(即:慢性间断性缺氧)的EHYP大鼠模型,观察Vit E对EHYP大鼠学习记忆及脑内胆碱乙酰转移酶(choline acetyltrans2ferase , ChAT)活性的影响,为寻找改善OSAS患者学习记忆障碍的方法提供实验依据。
材料和方法
一、材料
Vit E(T3634 , 1000 IUPg , Sigma公司。用大豆油稀释,配成50 IUPml和5 IUPml两种浓度。) , 3H2乙酰CoA(185CiPmmol , Amersham Life Science公司) ,常压低氧舱
(中国医学科学院阜外医院肺心病研究室) ,O2 、CO2 浓度测定仪(上海嘉定学联仪表厂) ,程控避暗箱(中国医学科学院药物所) ,液闪仪(西安262厂) 。
二、方法
1.实验动物和分组:雄性SD大鼠40只, 190～200g ,购自北京协和医院动物中心,经被动避暗回避反射试验初筛后,将符合条件的34只大鼠随机分为对照组( n = 7) 、EHYP组( n = 9) 、Vit E大剂量组( n = 9)和Vit E小剂量组( n = 9) 。经35天EHYP处理后死亡7只,最终各实验组大鼠数目为:对照组7只, EHYP 组7只,Vit E大剂量组6只,Vit E 小剂量组7只。各实验组大鼠缺氧前体重、缺氧后体重和增加体重无显著性差异( P> 0. 05) 。
2.动物模型的建立: (1) EHYP组参照薛全福等制作EHYP大鼠模型。将大鼠置于常压低氧舱内,向舱内注入氮气,同时在舱内放大量碱石灰和硅胶以吸收CO2 和水蒸气,使舱内氧浓度持续控制在10 ±0. 5% ,CO2 浓度始终< 3 % ,湿度为50±10 %。舱壁有小缝隙与舱外相通,使舱内气压与大气压平衡。每次缺氧时氧浓度从23 %降至10 %的时间为45分钟。缺氧期间,大鼠摄食、饮水同常。缺氧前30min用直接灌胃法予1ml大豆油。每天缺氧8h ,连续缺氧35天后结束。(2)对照组除不行缺氧处理外,余条件同EHYP组。(3)Vit E大、小剂量组 缺氧前30min用直接灌胃法予1ml大(50 IUPml) 、小(5 IUPml)剂量Vit E代替大豆油,余处理同EHYP组。3.学习记忆的测定:参照Ando等用被动避暗回避反射试验测定大鼠学习记忆能力。检测步骤如下:(1)初筛期缺氧处理前,将大鼠背对洞口放入明室,启动计时器,90s 内进入暗室的大鼠作本实验用。(2)训练期 缺氧处理后,大鼠背对洞口放入明室,进入暗室后,通电刺激2s ,电激后5s取出大鼠,归回饲养笼。(3)测定期 训练后24小时,再将大鼠背对洞口置于明室,同时开启计时器,记录大鼠第一次进入暗室时间,为潜伏期(STL) ,观察5min ,始终未进入的大鼠STL规定为300s。
4.取材:行为实验后,大鼠断头处死,全脑取出置于冰盘上,依次取出皮层、海马和纹状体,去除脑膜和血管,迅速称重后置于液氮保存。为避免ChAT活性的周期性节律变化,各实验组大鼠均于9Am左右处死,且交替断头取材。
5. ChAT活性的测定:参照Fonnum的方法。将待测脑组织按1 : 20(WPV)加入10mmolPL EDTA的PB缓冲液(0. 05M , PH = 7. 4) 。用超速匀浆器制备匀浆液,取40ul至一空白试管,同时加入40ul反应液和20ul 3H2乙酰CoA ,于37度孵育30min。用反应终止液终止反应。将孵育液移入闪烁杯,加2ml四苯硼钠2乙腈溶液和10ml甲苯闪烁液,轻摇1min ,使生成的3H2乙酰胆碱提取到甲苯相(未利用3H2乙酰CoA则留在水相) 。静置10min后于液闪仪测定每分钟衰变率(Decay Per Minute , DPM)值。结合匀浆液的蛋白量,计算出ChAT活性,以pmol·mg蛋白·min表示。6.蛋白的测定:参照Lowry等方法,用考马斯亮蓝G2250与蛋白质相互作用后的吸光度值测定样品中的蛋白浓度。用牛血清蛋白作为标准蛋白。
7.统计学处理:所有数据用均数 ±标准差表示,多个样本间计量资料的比较用方差分析及Q检验作显著性检验,多个样本间非参数资料的比较用Nemenyi法作显著性检验,检验显著水平为P< 0. 05。
