六种染色后光镜观察法检测肝癌细胞凋亡
作者：杨连君，司晓辉，王文亮，王文勇，赵一岭，方正清
［摘 要］ 目的：探讨简便易行的在光镜下通过形态学观察检测细胞凋亡的方法，并对其进行比较。方法：首先用6%的乙醇作用6 h诱导人肝细胞癌细胞系HCC9204细胞凋亡，然后进行未固定细胞的台盼蓝染色、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染色，细胞固定后的Hoechst 33 258荧光染色、MayGrunwaldGiemsa(MGG)染色和常规HE染色等形态学观察，并进行末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测。结果：用低浓度乙醇诱导细胞凋亡后，大部分肝癌细胞为台盼蓝拒染，TUNEL阳性着色。除了台盼蓝染色法以外，AO/EB、Hoechst33 258、MGG和HE等染色法，以及TUNEL检测法均能够不同程度地显示典型的细胞变圆，细胞核深染，染色质边集、呈环状、团块或新月体状，以及细胞浆浓缩和“出泡”现象等细胞凋亡的形态学特征。AO/EB双染色法还能够显示呈致密浓染的黄绿色染色或出现黄绿色碎片的早期凋亡细胞，呈致密浓染的鲜红色染色或出现鲜红色碎片的晚期凋亡细胞，以及呈鲜红色膨大状的坏死细胞。结论：上述六种染色方法均可作为检测细胞凋亡的手段。除了台盼蓝染色以外，其余5种染色方法均可用于观察凋亡细胞的形态学变化。其中，从AO/EB双染色法还可以区分早期凋亡。晚期凋亡和坏死细胞。TUNEL法不仅能够通过检测凋亡细胞的DNA片段化来判别细胞凋亡，还可以从形态学上观察凋亡细胞。
［关键词］ 细胞凋亡；检测；形态学；肝细胞癌
Detection of Apoptosis in Hepatoma Cells under Optical Microscopic Observation after Stained by Six Methods
YANG Lianjun1,SI Xiaohui1,WANG Wenliang2,et al
(1.Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang,Hebei 050082，China;2.Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China)
Abstract:Objective To investigate some simple and convenient morphological methods to detect apoptosis under optical microscopic observation, and perform contrast study in them.Methods At first, human hepatocelluar carcinoma cell line HCC9204 cells were affected by 6% ethanol for 6 h to induce apoptosis. The nonfixed cells were stained with trypan blue and by the doublystaining method of acridine orange/ethidium bromide (AO/EB),then the cells were fixed and stained with fluorescent dye Hoechst 33 258,MayGrunwaldGiemsa (MGG) and normal H.E stainings, and at last Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining was performed.Results After affected by lowconcentration ethanol to induce apoptosis,most hepatoma cells were negative in trypan blue staining and TUNELpositive.Except for by trypan blue staining， typically morph ologically apoptotic characters such as pyknosis, circled,densestained nucleus and cytoplasm,nucleus granuling,ringing or crescenting,and cytoplasm bubbling in different extent could be seen in the cells stained by AO/EB,Hoechst 33 258,MGG,H.E and TUNEL Besides,early apoptotic cells which were densely green yellowstained or displaying green yellow fragments,late apoptotic cells which were densely cardinal redstained or displaying cardinal red fragments, and cardinal red swollen necrotic cells could be found in the AO/EB doubly stained cells.Conclusions All the above 6 staining methods can be used to detect apoptosis.The morphological characters of apoptotic cells can be observed after stained by all the other 5 methods except for trypan blue staining. Besides detecting apoptosis, early apoptotic cells,late apoptotic cells and necrotic cells can be distinguished by AO/EB doublystaining Not only apoptosis can be detected according to DNA fragmentation, but also the morphological characters of apoptotic cells can be observed in TUNEL staining.
Key words:Apoptosis;Detection;Morphology;Hepatocellular carcinoma
细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，在正常细胞的死亡与更新，胚胎组织的生长和发育，肿瘤细胞的发生和发展，以及机体的免疫耐受等许多生理和病理过程中具有重要的意义［1，2］。虽然目前有多种检测细胞凋亡的方法，但是尚缺乏简便易行的形态学检测方法［3，4］。我们以低浓度乙醇诱导人原发性肝细胞癌(以下简称肝癌)细胞系HCC9204细胞凋亡，进行未固定凋亡细胞的台盼蓝、吖啶橙溴化乙啶(AO/EB)染色，凋亡细胞固定后的Hoechst33 258、MayGrunwaldGiemsa(MGG)和HE染色等形态学观察，以及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测，以探讨简便易行的通过光镜下形态学观察进行细胞凋亡检测的方法。
1 材料和方法
1．1 细胞和主要试剂 人肝癌细胞系HCC9204为第四军医大学病理学教研室建立，用含10％新生牛血清的RPMI1640(美国Gibco公司产品)培养液，在饱和湿度和5％CO2条件下培养151。Hoechst33 258和EB均为美国Sigma公司产品。AO为美国Amresco公司产品。TUNEL试剂盒为德国BoehrmgerMannheim公司产品。
1．2 未固定凋亡细胞染色观察 把处于对数生长期的HCC9204细胞换为含6％乙醇的培养液继续培养6 h(以正常生长的和经用含10％乙醇的培养液培养6 h后的HCC9204细胞作为正常和坏死细胞对照)，然后进行以下染色和观察：收集离壁漂浮的细胞，加入终浓度为0．4％的台盼蓝3 min后，细胞滴片于倒置显微镜下观察；将25 Ld离壁漂浮的细胞悬液与2 μlAO染液(100 μg/ml)和2 μl EB染液(100 μg/ml)混合后滴片，立即用荧光显微镜观察。
1．3 凋亡细胞固定后染色观察 将生长于盖玻片上的对数期HCC9204细胞换为含6％乙醇的培养液继续培养6 h(以正常生长的和经用含10％乙醇的培养液培养6 h后的HCC9204细胞作为正常和坏死细胞对照)，然后进行以下染色和观察：玻片晾干后用MGG染液染色20 min，光镜观察；细胞用95％的乙醇固定后进行常规HE染色，光镜观察；细胞经体积比为3∶1的甲醇：冰乙酸4℃固定5 min后，用Hoechst33 258(5 μmol/L)染色10 min，立即用荧光显微镜观察。
1.4 凋亡细胞的TUNEL法检测 将生长于盖玻片上的对数期HCC9204细胞换为含6％乙醇的培养液继续培养6 h后，晾干并经4％的多聚甲醛固定30 min，置4 ℃的穿透液(含1 g/LTritonX100的1 g/L枸橼酸钠)中2 min，用FITC标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶组成的TUNEL反应液(以PBS为阴性对照)于37 ℃染色60 min，立即用荧光显微镜观察。
2 结果
2．1 台盼蓝染色 大部分细胞为台盼蓝拒染，而坏死对照的大部分细胞被染成淡蓝色，正常细胞对照中只有个别细胞为台盼蓝着色。
2．2 AO/EB双染色 大部分细胞主要呈致密浓染的黄绿色染色或黄绿色碎片(早期凋亡细胞)；部分细胞呈致密浓染的鲜红色染色或鲜红色碎片(晚期凋亡细胞)；少部分为鲜红色的膨大细胞。而在正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染，细胞浆桔黄或桔红色。坏死对照大部分为鲜红色的膨大细胞。
2．3 MGG染色 正常细胞呈细胞核粉红色，细胞浆淡蓝色着色。实验组的大部分细胞固缩变圆，整个细胞呈深蓝色。坏死对照为形状不规则的淡蓝色膨大细胞。
2．4 HE染色 可见典型的细胞变圆，细胞核深染，染色质边集、呈环状、团块或新月体状，以及细胞浆浓缩和“出泡”现象等变化。而对照组未见上述变化。
2．5 Hoechst33 258染色 正常细胞的细胞核为弥散均匀的圆形或椭圆形荧光。实验组的细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒、新月体或环状荧光。坏死对照也可见颗粒状荧光，但呈松散和淡染状。
2.6 TUNEL法检测 阳性信号为黄绿色或黄色荧光，局限于细胞核内，呈圆形、椭圆形、新月体形或环形。实验组的大部分细胞为阳性着色。阴性对照中未见阳性信号。
3 讨论
低浓度乙醇主要对细胞产生两方面的损伤作用：破坏细胞的线粒体和微粒体电子传递系统，损伤细胞合成ATP和激发脂质过氧化的功能，使细胞生物膜流动性改变；导致细胞基因组DNA断裂，抑制DNA修复酶的功能［6］。我们以往用透射电子显微镜观察发现，低浓度乙醇能够使HCC9204细胞发生细胞核和细胞浆深染，染色质呈边集变化。细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞仪分析检测到凋亡细胞的特征性亚二倍体峰［7,8］。因此，本实验用低浓度乙醇诱导HCC9204细胞凋亡作为凋亡细胞模型。本实验采用台盼蓝、AO/EB、MGG、HE、Hoechst 33 258和TUNEL染色等6种细胞凋亡检测方法，从多个角度观察了低乙醇诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化。除了台盼蓝染色以外，其余5种观察方法基本上概括了凋亡细胞的形态学特征，即细胞固缩、变圆，细胞核和细胞浆浓染，细胞核呈颗粒状、环形或新月体状，细胞浆可见“出泡”等现象。说明上述方法对通过光镜形态学观察来检测细胞凋亡都具有一定的意义。AO能够透过细胞膜，把细胞核内的DNA染成绿色，细胞浆内的RNA呈桔红色。早期凋亡细胞的细胞膜尚完整，细胞浆发生固缩，细胞核固缩或碎裂，因此呈致密浓染的黄绿色，有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的细胞膜通透性增加，EB能够通过，使其呈鲜红色固缩体或碎块。坏死细胞不仅细胞膜不完整，而且线粒体肿胀，为鲜红色的膨大细胞［9］。本实验的结果也表明，AO/EB染色法对区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞具有一定的意义。TUNEL法的原理是利用TdT对断裂的双链DNA进行末端标记。在细胞凋亡早期对凋亡细胞和坏死细胞的鉴别上，它优于以往采用的DNA聚合酶或Klenow酶催化的原位末端标记技术［10，11］。本实验结果显示，大部分TUNEL染色阳性的细胞同时具有明显的细胞核颗粒状、环形或新月体状等凋亡细胞形态学特征，说明TUNEL技术可原位同时显示凋亡细胞的形态和分布。部分TUNEL阳性的细胞呈圆形或椭圆形，未见明显的凋亡细胞形态学变化，说明这些细胞可能是处于凋亡早期的细胞，TUNEL法能够检测到早期的凋亡细胞。
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解放军白求恩国际和平医院，河北 石家庄 050082； 第四军医大学，陕西 西安 710032)
