蛋白酶的测定实验——茚三酮测定法
| 实验方法原理 | 茚三酮反应是一种灵敏度高的蛋白实验。游离的氨基酸可以被高敏感性检测出来。这个方法可以被用来继续蛋白质的酶降解。上述的酪蛋白降解在这个实验系统中用作蛋白酶反应。未水解的蛋白质被三氯乙酸沉淀下来，而茚三酮反应发生在上清液。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 酪蛋白降解 0.4 ml 酪蛋白底物恢复到 35℃，0.2 ml 蛋白酶溶液溶于 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0，加入 10 mmol/L CaCl2。35℃ 培养混合物，10 min 后加入 1 ml 1.2mol/L TCA 停止反应。用同样的方法处理空白对照，不同点是加入 TCA 后，向酪蛋白底物中加入蛋白酶溶液。离心样品 5 min。 2. 萌三酮反应 0.2 ml TCA 上清液 0.1 ml 0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液 0.1 ml 茚三酮试剂 在水浴中放置 10 min 或者加热箱中加热到 100℃，而后在冰中冷却 1 min，再加入 0.5 ml 50％ 乙醇。用水取代水解产物后，相对于空白对照检测在 570 nm 处的吸收值。 3. 校准曲线 为了定量，用 12 份（1～50 ul，补充至 200 ul）10 mmol/L 亮氨酸溶液绘制校对曲线。 展开 |
| 其他 | 试剂： 0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，包含 10 mmol/L CaCl2（1.47 g CaCl2·2 H2O 溶于 1 L） 0.2 mol/L NaOH（Mr＝40.0；0.8 g 溶于 100 ml H2O） 0.2 mol/L 乙酸（Mr＝60.05；12 g 溶于 1 L） 1.2 mol/L 三氯乙酸（TCA，Mr＝163.4；19.6 g 溶于 100 ml H2O） 酪蛋白底物：2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl2 和0.2 mol/L NaOH，而后用 0.2 mol/L 的乙酸调 pH 至 8.0，并用 H2O 将溶液补充至 100 ml。溶液被分为等分试样并储存于 -20℃。 2 mol/L 乙酸缓冲液，pH 5.4［溶解 270 g 三水乙酸钠（C2H3O2Na·3H2O，Mr＝136.1）于 200 ml H2O，加 50 ml 冰醋酸并补充至 1 L］ 10 mmol/L KCN（Mr＝65.1；65 mg 溶于 100 ml H2O）； 0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液（0.2 ml 10 mmol/L KCN＋9.8 ml 乙酸缓冲液，新鲜制备）茚三酮试剂（2，2-二羟基-1，3-茚满二酮，Mr＝178.1，可购买到） 50％ 乙醇 标准 BSA 溶液，40 ug/ml，将储存液稀释 100 倍，100 mg 溶于 25 ml 水中制备而得。 10 mmol/L 亮氨酸（DL-亮氨酸，Mr＝131.2；131 mg 溶于 100 ml 水中） 蛋白酶溶液 展开 |
