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非抑制离子色谱法测定左旋肉碱

2020.3.06

【非抑制离子色谱法测定左旋肉碱】

左旋肉碱(L-carnitine, β-羟基γ-三甲铵丁酸)又称肉毒碱或维生素BT，其化学式为C₇H₁₅O₃N，分子量为162.2，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸。L-肉碱的主要功能是参与动物体内的脂肪代谢，它作为载体将长链脂肪酸从腺粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的β-氧化，从而促进脂肪的代谢，因此左旋肉碱具有多种重要的生理功能。

左旋肉碱已广泛应用于医药、保健和食品等领域，被瑞士、法国、美国和世界卫生组织规定为法定的多用途营养剂。我国食品添加剂卫生标准GB2760-1996规定了左旋肉碱酒石酸盐为食品营养强化剂，可应用于咀嚼片、饮液、胶囊、乳粉及乳饮料等。市场上已出现了许多以左旋肉碱为主要功能的减肥产品。

左旋肉碱极性较强，缺少发色基团，定量分析困难。国内外对左旋肉碱的测定主要有酶法、电泳法、电化学法，高效液相色谱法等。高效液相色谱法中有的需要衍生、有的灵敏度较低。其它方法准确性较差，设备较贵等原因较少使用。

离子色谱法可测定在水溶液中能电离的物质。在酸性溶液中，左旋肉碱表现为阳离子特性，带正电荷，可用阳离子交换色谱柱分离。但左旋肉碱的两性特征使其无法采用抑制型电导检测。为此，我们通过实验，摸索出左旋肉碱的非抑制型离子色谱测定的新方法。该方法前处理简便、检测快速，用于实际样品的检测，结果令人满意。

实验条件

仪器条件

仪器：ICS系列离子色谱系统带柱温箱;分析柱：IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm;流动相组成：MSA：0~22 min，5 mM;流速：1 ml/min;柱温：30℃;检测方式：抑制型电导检测;进样量:25 µl。

样品前处理

胶囊：拆开胶囊外皮，称取其中的粉末样品约0.1g，至100 ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液，4000 r/min离心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和On Guard II RP柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品用于离子色谱测定。

咀嚼片：将咀嚼片粉碎，混匀，称取其中的粉末样品约0.1 g至100ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液，4000 r/min离心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和On Guard II RP柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品用于离子色谱测定。On Guard II RP柱(2.5 cc)，预先使用10 ml甲醇和15 ml水活化。

结果与讨论

前处理条件的选择

减肥产品中，通常加入左旋肉碱稳定形式的左旋肉碱酒石酸盐。左旋肉碱酒石酸盐易溶于水，但不易溶于有机溶剂。离子色谱的淋洗液是水溶液，因此选用水作提取剂。对用水作溶剂提取极性化合物，超声提取是有效的提取方法。我们考察了用超声提取时，提取温度与提取时间对回收率的影响，实验结果列于表1和表2。

从表1数据可见，增加提取时间，测得结果逐渐增大，当提取时间大于20min后，提取效率增大不明显了。考虑到某些基体复杂的减肥产品，可将提取时间适当延长，因此提取时间选择为30 min。表2中，30 ℃时测得左旋肉碱含量已经是50 ℃时的99.9%，这说明30 ℃左旋肉碱的提取已经充分。因此选择在30℃、30 min下超声提取即可。

表1. 30℃下，提取时间对回收率的影响

表2. 提取温度对回收率的影响

色谱柱的选择

按实验方法，我们比较了左旋肉碱在IonPac SCS1、IonPac CS12A、IonPac CS17三种不同色谱柱上的出峰及分离情况。SCS1柱为硅胶基质的色谱柱，不耐酸碱，虽然可用低浓度(3 mM)的淋洗液等度洗脱，但L-肉碱在该柱拖尾严重，对称因子为4.05，灵敏度不高。CS12A柱的离子交换功能基团为羧基/磷酸基，柱容量高(2800 ueq)，亲水性较CS17柱弱，对一价和二价阳离子的保留相对较强，对疏水性比较强的L-左旋肉碱离子保留比较强，需用高浓度的淋洗液才能洗脱保留的阳离子，这会导致高的背景电导和高的检出限。采用15.56 mM的甲基磺酸在CS12A柱上等度淋洗左旋肉碱，背景电导5371 uS，色谱峰的对称因子2.25，理论塔板数1936，可见对称性和柱效也不好。CS17柱功能基团为羧酸基，柱容量(1450 ueq)较CS12A柱低，可用较低浓度的淋洗液洗脱一价和二价阳离子，因此降低背景电导，提高检出限。L-肉碱在此色谱上对称性良好，5 mM等度淋洗，对称因子为1.17，与可能存在的其它阳离子易于分开。因此，选择CS17 + CG17作为分析L-左旋肉碱的色谱柱。

淋洗液浓度的确定

我们选用不同浓度的甲基磺酸，测定混合标样a中左旋肉碱的色谱分析特征。随着淋洗液浓度降低，背景电导降低，噪声降低，理论塔板数提高，各成分间的分离度增大，对称因子降低，峰形改善(如表3所示)。但由于浓度降低，酸度降低，导致峰高降低，灵敏度降低。因为L-肉碱是弱碱，溶液的酸度减弱，L-肉碱的解离减弱，电导响应也将减弱。同时，更低浓度的酸使各成分的保留时间明显增长，特别是两价离子的保留时间增加更多，当浓度

降低到3 mmol/L时，Ca²⁺的保留时间大于50 min，不利于提高分析效率(如表4所示)。综合考虑，我们选择5 mmol/L的甲基磺酸作为分析用淋洗液。

表3. 不同淋洗液浓度对左旋肉碱分析能力的影响

表4. 不同淋洗液浓度对各种离子保留时间的影响

a Li⁺(0.5 mg/L); Na⁺(5 mg/L); NH₄⁺(5 mg/L); K⁺(5 mg/L); L-carnitine(400 mg/L); 6 Choline+Acetylcholine(50 mg/L + 50 mg.L) ; 7 Mg²⁺(5 mg/L); 8 Ca²⁺(5 mg/L)

干扰实验

由于钾、钠、钙、镁、铵为水中的常见离子，在样品中普遍存在。而某些含左旋肉碱的保健产品也会添加胆碱类类物质例如胆碱及乙酰胆碱来促进脂肪运输和神经发育。因此我们考察了常见阳离子及胆碱和乙酰胆碱对左旋肉碱出峰的影响。从图1可见，常见六种阳离子能与左旋肉碱较好分离。50 mg/L的胆碱和乙酰胆碱与400 mg/L的左旋肉碱出峰互相不干扰，分离度达到2.72.

图1. L-肉碱及共存离子分离色谱图。