精确修饰位点谱图库的建立与磷酸化蛋白质组的 DIA 解析2
2. 磷酸化样本的 DDA 鉴定、可信度筛选和谱图库建立
磷酸化样本信息和色谱质谱参数见实验条件部分。3 针 DDA 数据按磷酸化检索流程使用 Proteome Discoverer 2.0 软件搜库鉴定（S/T/Y+79.966 Da），并使用 ptmRS 模块对位点打分（图 2-1）。搜库完成后，打开结果，使用 Filter 功能对 PSM 列表“Isoform Confidence Probability”项进行筛选，保留得分大于等于 0.75 的 PSM（图 2-2）。然后，点右键选择”Check All-In This Table”，将符合条件的PSM选定。最后，在”Spectra”中导出mzML格式，在“To PepXML”中导出 PepXML 格式，并将两个文件置于同一文件夹中，即可作为谱图库导入 Skyline（图 2-3）。
图 2. 翻译后修饰 DDA 数据检索、位点筛选和结果导出步骤
经 phosphoRS/ptmRS 计算得到每个磷酸化位点的打分（Site Probability），分数 > 75（或 0.75）则位点有确切的碎片支持，定位可靠。搜库引擎没有针对位点打分的功能，位点定位错误概率大。图 3 是一个典型的例子：RFSVTAEGGLTLEQVTDAR 肽段搜库鉴定出包含 1 个磷酸化位点的多个 PSM，3 号位丝氨酸和 5 号位苏氨酸均有匹配到磷酸化发生（FDR < 1%）。而 ptmRS 的打分结果却分 3 种情况：1) ptmRS 得到唯一可靠的位点，且与搜索引擎得到的位点一致，此时 Isoform 100% 确定（图 3-A）；2) ptmRS 得到两个位点都有可能，无法确定唯一位点，此时 Isoform 可靠度为 50%（图 3-B）；3) ptmRS 得到唯一可靠的位点，但与搜索引擎得到的位点不一致，此时 Isoform 可靠度为 0（图 3-C）。最终，只筛选 Isoform打分（Isoform Confidence Probability）_ 75（或 0.75），即所有位点均明确、可靠的肽段建立谱图库。
图3. 搜库引擎/ptmRS结果一致、部分一致、不一致三种情况示例
实验共鉴定 56617 张 PSM（FDR < 1%），经过 Isoform Confident Probability 筛选，共获得 30558 张精确定位、isoform 唯一的磷酸化肽 PSM（图 4），结果导成 mzML 和 PepXML 格式作为谱图库。
图 4. Isoform Confident Probability 筛选前后 PSM 比较
3. 基于精确谱图库的磷酸化样本 DIA 数据解析
将 mzML 和 PepXML 格式文件导入 Skyline 生成磷酸化肽谱图库，用于磷酸化肽段 DIA 数据解析。Skyline 将谱图库中所有肽段作为 targets 对 DIA 数据中进行提峰，每条肽段选取 3 个母离子（单同位素, 单同位素 +1, 单同位素 +2）和 6 个响应最高的 b/y 离子。提峰结果使用 mProphet 进行假阳性评估，Q 值 < 0.01（即 FDR < 1%）为可信的提峰结果。
