分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

精确修饰位点谱图库的建立与磷酸化蛋白质组的 DIA 解析3

2020.5.18

结果显示，从 DIA 数据中提取、定量到 6401 条可信的磷酸化肽，占谱图库磷酸化肽总数（6505 条）的 98.4%（图 5）。磷酸化肽的丰度和离子化效率普遍较低，本实验如此高的解析成功率表明，基于 Orbitrap 的 DIA 数据具有极高的谱图质量和出色的灵敏度。

图5. DIA可靠解析的磷酸化肽占谱图库总数的98.4%

进一步对 6401 条磷酸化肽 XIC 色谱峰面积的三针重现性进行统计。将每条肽的母离子和子离子峰面积分别加和，选取两者中重现性最好（即 CV 值最低）的结果用于定量。一般认为，峰面积 CV 值 < 20% 时定量结果可靠、准确。统计结果显示，峰面积 CV 值 < 20% 的磷酸化肽占总数的 86.9%（图 6）。如此高的重现性说明 Orbitrap DIA 不仅具有出色的灵敏度，同时具有优越的重现性，胜任复杂的翻译后修饰定量。

图 6. 磷酸化肽峰面积重现性（CV 值）统计

图 7 展示了一个典型的磷酸化肽 DIA 解析结果。该磷酸化肽有 2 种异构体，分别在 3 号位和 9 号位的丝氨酸上发生了磷酸化。得益于高质量的 DIA 谱图和严格的谱图库建立，即使这 2 种异构体保留时间非常接近，也能成功、准确地分辨。DIA 获得的碎片丰度比与谱图库非常接近，匹配打分的 dotp 值均在 0.95 以上。

图 7. 磷酸化肽异构体在 DIA 中的分辨和匹配打分（dotp）

结论

翻译后修饰由于肽段上修饰位点的多重性和不确定性，难以获得可靠的 DIA 结果，这一问题是 DIA 发展的瓶颈所在。另一方面，phosphoRS/ptmRS 和 MaxQuant 等算法和软件的发展，使翻译后修饰位点的 DDA 鉴定、定位更加准确。本文基于上述算法和软件对磷酸化样本的 DDA 鉴定结果进行位点打分，并筛选出位点定位准确、可靠的谱图建立谱图库用于 DIA 分析，成功从磷酸化样本 DIA 数据中提取 6401 条可靠的磷酸化肽（Q < 0.01），占谱图库中磷酸化肽总数的 98.4%。其中，86.9% 的肽段峰面积 CV < 20%，可用于精确的磷酸化定量。该策略有效解决了翻译后修饰 DIA 定量的难题，证明基于 Orbitrap 超高分辨质谱技术的 DIA 流程兼具出色的灵敏度和优越的重现性，是复杂样本定量特别是翻译后修饰样本定量的最佳选择。

参考文献

[1] Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline, Nat. Protoc., 2015, 10(6): 887-903

[2] Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues, Mol. Cell. Proteomics, 2015, 14(5): 1400-1410

[3] MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments, Mol. Cell. Proteomics, 2015, 14(9): 2405-2419

[4] Universal and confident phosphorylation site localization using phosphoRS, J. Proteome Res., 2011, 10(12): 5354-5362

[5] MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification, Nat. Biotechnol., 2008, 26(12): 1367-1372

互联网

喜欢作者我要约稿

喜欢作者

打赏方式

精确修饰位点谱图库的建立与磷酸化蛋白质组的 DIA 解析3

周锦帆