cDNA宏阵列方法分离拟南芥的臭氧应答基因实验（一）
实验步骤
##一、 cDNA 宏阵列的样品制备
培养基： I : 2 (V7 V ) Gamborg B5 培 养 基（GibcoBRL， Rockville, MD), I : 1000(V /V ) Hyponex肥 料（Hyponex 10 : 5 : 10; Hyponex Japan, Osaka， Japan), 1 % 鹿糖 ； pH调 至 5. 7。
##二、 cDNA宏阵列探针制备（见注释 1〜4)
1.4 mol/L 硫 氢 酸 胍（guanidium thiocyanate) 溶 液 ： 4 mol/L 硫氧酸胍， 0 •1mol/LTris-HCl, p H 7. 5， l0mmol/L E D TA , 0 . 5 % 十二焼基肌氨酸钠， 0.1%β-疏 基 乙 醇
2.酸 -氯 仿（Phenol-chloroform): 50% (V. V ) 液态酚， pH 8.0， 4 8 % (VvV ) 氯仿， 2 % (V/V ) 异戊醇。
3.5.7 mol /L[氯化铯垫层： 5.7 mol/L氯化铯， 0.1mol/LEDTA,pH调至7.5。
4.DEPC 水 ： 0 . 1 % 焦碳酸二乙酯（DEPC)。
5.10X 杂交液： 1.2 mol/L NaCL 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0， 50 mmol/L EDT A , 1 0 % 十二烷基磺酸钠（SDS)。
6.BPB溶液： lOmmol/LTris-HCl， p H 7.5, 0.25% 溴酚蓝， l mmol/L E D TA ，pH 8.0, 6 0 % (V/V) 甘油。
7.碱溶液： 0. 5 mol/L NaOH， I.5 mol/L NaCl。
8.中和液： I.5 mol/L NaCl， 0. 5 mol/L Tris-HCl; pH 调至 7. 4。
9.2XSSC: 300 mmol/LN aCl， 30 mmol./L 柠檬酸钠。
##三、 cDNA宏阵列杂交
1.5 XM-MLV RT 缓冲液： 250 mmol/L Tris-HCl， pH 8.3, 375 mmol/L KC1，15 mmol/L MgC^ 0
2.不含 dCTP 的 dNTP 混合液： 20 mmol/L dATP， 20 mmol/L dTTP， 20 mmol/L dGTP。
3.杂 交 液（Church 磷酸缓冲液）： 0.5 mol/LNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,1mol/L EDTA，1μg/mL poly dA (Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)， 7 % SDS， pH 调至 7. 2。
4.0.2 XSSC: 30 mmol/L NaCl， 3 mmol/L 梓樣酸钠。
##四、方法
###1 cDNA宏阵列的样品制备
（1）选 用 拟 南 芥 户 sis Heyhn accession Columbia ( Col-O;
ABRC， Columbus， OH)。
（2）用来构建cDNA 文库的植株在22°C下按照16 h 光 照 ： 8 h 避光的周期进行土壤培养。
（3）生长2〜6 周的植株收集地上部分，包括花苞和绿色果荚。植株的水培养是把消毒后的种子散布入培养基，在 22°C下进行不间断的光照和旋转培养2 周。水培养的植株收集幼苗和根。
（4）为提取mRNA，先把植株在石棉块上萌发，并 在 25°C , 5 0 % 〜6 0 % 相对湿度，100 pmol HT2 s-1光量子通量密度（PPFD)， 14 h 光 照 ： 10 h 避光周期的条件下在叶箱中培养。
（5）用稀释2000 倍 的 5 : 10 : 5 营 养 液（Hyponex， Hyponex Japan) 烧灌植株。两周大的植株在臭氧叶室中进行200 nL.L O3处 理 12 h (7)。臭氧叶室保持25°C ，7 0 % 相对湿度， 100 (umol DT2sH PPFD的连续光照培养条件。环境空气中培养的植株作为实验的对照组。臭氧由臭氧发生器（Sumitomo Seika Chemical, Tokyo, Japan) 产生。
###2 cDNA宏阵列的探针制备（8）
####（1） Poly (A )+ R N A 的提 取
1.利用硫氢酸胍-氯化铯超速离心法提取地上部分、花苞、根部、 2〜6 周大的植株和水培幼苗的总 RNA (9)。
2.取 ％ 冷冻组织，在液氮中研磨成粉，加 人 25 mL 4 mol/L 硫氢酸胍缓冲液。
3.匀浆于室温， 5000 g 离 心 10 min。
4.将上清液转移到新的离心管中并加入等体积酸- 氯仿，混匀。
5.5000 g 室温离心5 min。
6.将上清液转移到新的离心管中，重复步骤4 和 5 四次。
7.取上清，置 于 离 心 管 中 的 氯 化 铯 垫 层（15 m L , 5.7 mol/' L ) 之上， 20°C ，271 000 g•离心 22 h，离心机转子为 RP50VF (Hitachi Koki， Tokyo, Japan)。
8.弃去离心管上清，并将离心管倒置于纸巾上吸去多余液体。
9.用 7 0 % 乙醇室温下清洗沉淀，弃上清，吸去多余液体。
10.RN A沉淀晾干，用 DEPC 水溶解。
