一例轮枝镰刀菌眼部感染病例分析
镰刀菌为条件致病性真菌，广泛分布于自然界土壤、植物的地上及地下部分或植物碎片。我国从事农业人口居多，农业性眼外伤多见，为镰刀菌的角膜种植性感染提供机会。本文介绍1例眼部感染轮枝镰刀菌的病例。
病历摘要
患者，男，73岁。2个多月前，劳作时左眼不慎被红薯藤叶划伤，4 d后出现左眼红痛、畏光、流泪、视力下降，伴眼胀痛、异物感，于当地医院就诊，予以抗炎药物(抗生素滴眼液，具体不详)对症治疗，效果不明显。1个月前左眼病情加重，继续使用抗生素点眼治疗无效，为求进一步治疗，于 2017年2月9日入住本院眼科。查体:T 36.4 ℃，P 76 次/min，血压150/90 mmHg。右眼视力.8，左眼视力光感，左眼结膜混合充血、水肿，左眼中央角膜全层浸润浑浊，卫星灶(见图1)，颞上、鼻上角膜轻度水肿，角膜内皮斑，前房黏稠积脓，内窥不清。
图1 左眼中央角膜病灶
入院后根据查体特征，留取眼部分泌物行细菌、真菌培养，并给予左氧氟沙星滴眼液、普拉洛芬滴眼液、氟康唑眼液局部点滴患眼，同时给予氟康唑静滴等抗炎对症治疗。2月16日行左眼球内容物剜除+义眼植入术，再次留取术中角膜组织行细菌、真菌培养。术后因患者并发冠心病，转入心内科继续治疗。
病原学检查
1.直接涂片及细菌真菌培养
入院当日将病灶分泌物拭子直接涂片革兰染色镜检，并接种血琼脂平板、中国蓝琼脂平板、不含抗生素巧克力琼脂平板，置35 ℃行细菌培养;接种沙氏琼脂平板、土豆琼脂平板，置25 ℃行真菌培养。涂片未见病原菌。血琼脂平板、巧克力琼脂平板培72 h未见病原菌生长，为提高苛养菌的检出，随后延长培养至7 d，未见病原菌生长;沙氏琼脂平板、土豆琼脂平板培养28 d未见病原菌生长。
手术当日将送检的角膜组织标本，部分用组织研磨器研磨成匀浆，用以常见细菌(包括苛养菌)、真菌、分枝杆菌的检出;部分用组织剪剪碎，用以接合菌的检出。将两者混合物分别接种血琼脂平板、厌氧琼脂平板、巧克力琼脂平板、沙氏琼脂平板、土豆琼脂平板以及罗氏培养基，并分别制作革兰染色涂片、抗酸染色涂片以及六胺银染色涂片各1张。涂片均未见可疑病原菌。72 h后，血琼脂平板、巧克力琼脂平板、沙氏琼脂平板以及土豆琼脂平板均生长出白色真菌菌落，生长迅速，5 d后，血琼脂平板、巧克力琼脂平板培养菌落呈羊毛状生长，表面淡黄色(见图2);沙氏琼脂平板菌落为羊毛状，表面淡黄色，边缘白色，中央黄褐色，背面黄色(见图3);土豆琼脂平板菌落为羊毛状，表面淡黄色，边缘白色，中央黄褐色(见图4)。56 d罗氏培养基未见分枝杆菌生长。
图2 血琼脂平板5 d菌落形态
图3 沙氏琼脂平板5 d菌落形态
图4 土豆琼脂平板5 d菌落形态
菌落乳酸酚棉蓝染色后镜检可见分隔菌丝，产孢细胞为简单瓶梗。有2类分生孢子:一类无分枝或分枝分生孢子梗上的瓶梗可生成 2～6 μm× 14～80 μm、镰刀形或独木舟形的大分生孢子(3～5个隔膜);一类长短不一的简单分生孢子梗可生成2～4 μm×4～8 μm，卵圆形、单或双细胞的小分生孢子，其呈单个或成簇聚集(见图 5)。形态学鉴定为镰刀菌属。
图5 菌落乳酸酚棉蓝染色镜下形态(×400)
2．内转录间隔区(ITS)检测
用Primer Premier引物设计软件，针对真菌核糖体RNA基因序列设计通用引物，序列分别为ITS1(F):5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4(Ｒ): 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由北京睿博兴科公司合成。严格按照提取试剂盒(QIAamp DNA MiNi kit，Qiagen 公司) 提取真菌 DNA。ITS PCR扩增体系共25 μL，包括Mix 12.5 μL，100 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，DNA 2 μL，ddH 2O 9.3 μL。PCＲ反应条件:94 ℃变性10 min;94 ℃ 变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物纯化后送北京睿博兴科公司测序。所测序列在 GenBank 核酸序列数据库中进行同源序列比对，筛选相似度≥99% 的序列，结果为轮枝镰刀菌，亦即串珠状赤霉。
讨论
真菌性角膜炎是一种病情严重，致盲率高的眼部感染性疾病，其常见致病菌为镰刀菌，其中以茄病镰刀菌最为多见，其次为串珠镰刀菌。该病例患者劳作中左眼被植物藤叶划伤，经验抗感染治疗无效，眼部检查左眼中央角膜全层浸润浑浊、卫星灶，符合眼部真菌感染的流行病学及体格特征。病变组织微生物培养形态学鉴定为镰刀菌属，基因测序鉴定为轮枝镰刀菌。
该病例中患者由于没有进行及时的抗真菌治疗，贻误了最佳治疗时机，采取左眼球内容物剜除+义眼植入术。因此，对于眼部外伤患者，真菌感染需引起高度重视，尽早诊断并给予积极治疗是保障患者疗效及预后的关键因素。资料显示，镰刀菌对氟康唑、酮康唑、棘白菌素类药物天然耐药。镰刀菌对两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、氟康唑的敏感性分别为94.35%、7.11%、39.39%、82.22%、0.00%。提示在临床工作中，对于可疑真菌性角膜炎，经验抗感染治疗应覆盖镰刀菌。而对于镰刀菌的治疗，应恰当选用两性霉素 B等药物，氟康唑可能无效。
该病例中分别送检患者眼部分泌物拭子及病变角膜组织行微生物培养，患者眼部分泌物拭子培养未见病原菌生长，而病变角膜组织培养出镰刀菌，分析其原因可能为侵袭性真菌感染中，致病性真菌常侵入组织生长，而分泌物标本中大多为坏死的混合细胞成分，从而使送检分泌物标本中病原菌检出率降低。以上说明感染性疾病病原学诊断中送检组织标本对病原菌诊断的重要性。
