中途胚胎植入前遗传学诊断／筛查病例报告-2
三、讨论
计划ＰＧＤ／ＰＧＳ在胚胎实验室的流程为：取卵→ ＩＣＳＩ受精→Ｄ３胚胎期打孔→Ｄ５囊胚活检→囊胚 冷冻 → 对回报可用囊胚择期行解冻移植。而在 Ｍｉｄｗａｙ ＰＧＤ／ＰＧＳ，实验室流程被动变为取卵→ ＩＶＦ受精→囊胚冷冻→囊胚解冻复苏→囊胚打孔、 活检→再次囊胚冷冻→对回报可用囊胚择期再次行 解冻移植。那么以下问题就需要探讨：（ １）ＰＧＤ／ ＰＧＳ能否采取ＩＶＦ受精？（ ２）囊胚期打孔是否可 行？（ ３）反复冻融对胚胎发育有无影响？为此我们 复习了多项ＰＧＤ／ＰＧＳ指南，包括２００４年ＰＧＤ国 际协会颁布的 ＰＧＤ 技术指南及于２００８年修正的 ＰＧＤ操作流程及实验室质量保障指南［ ２］、欧洲人类 生殖与胚胎协会（ ＥＳＨＲＥ）ＰＧＤ联盟就 ＰＧＤ实验 室的设立及相关的３项技术———ＤＮＡ扩增技术、荧 光原位杂交（ ＦＩＳＨ）技术和胚胎活检———建立的相 关指南［ ３ －５］、 ２０１５ 年 Ｔｕｒ －Ｋａｓｐａ 等［ ６］提出的用于 ＨＬＡ配型的 ＰＧＤ 指南及 Ｇｉｒａｒｄｅｔ等［ ７］２０１６年提 出的囊性纤维瘤ＰＧＤ指南、加拿大妇产科医生协会 ２０１５年发布的胚胎植入前基因诊断和筛查技术指 南［ ８］，以及其他相关文献，以期回答上述问题。 １．ＰＧＳ／ＰＧＤ 受精采用ＩＣＳＩ还是ＩＶＦ：选择 ＩＣＳＩ的理由包括：（ １）增加２ＰＮ率，提高卵子利用效 率；（ ２）避免精子来源的污染。因此目前所有指南对 包含ＰＣＲ步骤的ＰＧＳ／ＰＧＤ均推荐使用ＩＣＳＩ，目的 即是减少来自黏附于囊胚透明带的父系精子 ＤＮＡ 污染；荧光原位杂交（ ＦＩＳＨ）则ＩＶＦ和ＩＣＳＩ受精两 者均可［ ５， ９］。进一步细分，所有ＰＧＤ中授精步骤均 推荐使用ＩＣＳＩ而非常规授精［ ４， １０］；而对于 ＰＧＳ，目 前美国 ＣｏｏｐｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ公司采用ＩＶＦ受精，并将 此写入其认证的操作流程。他们的依据在于，对多 达５０条的精子进行扩增后并无 ＤＮＡ产物，因此无 需担心粘附于透明带上的精子污染。但对ＰＧＤ病 例仍要求采用ＩＣＳＩ授精，尤其是采用短串联重复序 列多态性连锁分析（ ＳＴＲ－ＰＣＲ）扩增进行单基因 ＰＧＤ时，因为细胞裂解过程可放大精子物质。由于 所用扩增方法不同，导致精子 ＤＮＡ 扩增程度也不 同，因此采用何种受精方式建议参考各实验室流程、 单细胞扩增技术和验证流程。此外，还需要关注另 一种污染，即卵丘细胞污染。有一例胚胎ＰＧＤ诊断 结果为４６，ＸＸ，但新生儿出生为４６，ＸＹ，其 ＤＮＡ指 纹显示为母体来源。推测原因可能是把一团粘附的 滤泡细胞误认为是脱出的滋养层细胞进行了“活检”。
不管采用哪种受精方法都有发生这种污染的可能，因 此操作人员在活检过程中仔细识别活检材料非常 重要。 ２．解冻囊胚打孔（ ｚ ｏｎａ ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）：针对囊胚 期活检，指南中推荐在胚胎期打孔、在囊胚期对从孔 中突出的滋养外胚层细胞进行活检［ １］。但也有缺 点：若后期形成的内细胞团位于打孔处，则活检操作 可能损伤已分化的内细胞，影 响 后 续 胚 胎 发 育［ １１ －１３］；效率低———打孔的胚胎不一定都能发育成 囊胚。也有文献尝试在囊胚期打孔［ １４］。相较卵裂 期打孔，囊胚期打孔优点在于：（ １）打孔位置可选择， 可避开内细胞团附着处；（ ２）避免对囊胚发育过程的 干扰。但该方法需要先对囊胚进行皱缩、等到囊胚 再次复张并孵出才能活检，部分情况下当天是无法 完成活检。本研究中为解冻囊胚，操作时可以选择 合适时机，即在囊胚解冻后尚有一定程度皱缩状态 下、选取远离内细胞团处、透明带薄、且和滋养外胚 层有一定间隙处打孔，然后放置培养箱孵育，待有滋 养外胚层细胞从打孔处突出时取活检，则可以最大 限度避免对滋养外胚层细胞的损伤。 ３．反复冻融对胚胎发育的影响：冷冻技术是 ＰＧＤ／ＰＧＳ过程中一项重要步骤，为囊胚活检后的 遗传检测赢得了时间。目前采用的玻璃化冷冻技术 经２０多年的发展，目前已广泛用于人类卵母细胞、 原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的冷冻，获得了较高 的解冻复苏率，很多文献报道冻融胚胎和冻融囊胚 移植是可行和安全的［ １５ －１７］。但目前尚缺乏对玻璃 化胚胎出生婴儿终生随访的全面资料，胚胎反复冻 融其临床有效性、安全性更需人们关注。临床工作 中胚胎反复冻融大都为特殊情况下的非常态操作， 相关的研究较少。２０１５年的一项研究显示，重复冷 冻组的胚胎种植率、临床妊娠率比单次冷冻组 低［ １８］；最新的一篇文献也显示反复冻融组自然流产 率高于对照组而活产率低于对照组［ １９］。二次冻融 影响妊娠结局可能与多个因素相关。首先，多次玻 璃化冷冻过程中使用较高浓度的冷冻保护剂可使细 胞发生毒性效应和渗透性休克。现普遍认为，乙二 醇是人胚胎、受精卵、卵母细胞玻璃化冷冻最有效的 低毒性冷冻保护剂，冻融后存活率高，但其与胚胎接 触时间过长（＞２ｍｉｎ）、温度过高（＞２５℃）时，其细 胞毒性作用增强。其次，尽管认为玻璃化冷冻中极 少有胞内冰晶形成，但当预平衡或暴露于玻璃化溶 液中时间过短时，会发生细胞脱水和冷冻保护剂置换不充分，此时会产生胞内冰晶，对细胞造成损伤。 反复冷冻情况下这些不良事件发生概率增加、不利 影响累加，最终可能影响到胚胎发育潜能。这就要 求胚胎学家操作严格按照流程进行，同时也要求我 们工作中尽可能个体化处理、准确预判，任何情况下 都要尽可能避免对胚胎反复冻融。 总之，中途行 ＰＧＤ／ＰＧＳ与计划行 ＰＧＤ／ＰＧＳ 在操作程序有诸多不同，现有指南未涉及，目前无指 导性建议。其中ＩＶＦ 受精、反复冻融有可能影响 ＰＧＤ准确率和胚胎进一步发育潜能，如何评价其效 果有待进一步积累经验。
参考文献略。
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