多个序列突变的筛查-HRMA（一）
摘要：双链DNA分子转化为两个单链分子，DNA分子变性或熔解用于研究DNA结构和组成已经有多年。最近，新技术的进步提高了这种技术的潜力，尤其是用于DNA序列突变的检测。通过饱和DNA染料的发展和设备的改善，熔解的灵敏度和特异性有了很大的提高（改良的温度精确地结合每个时间单位温度的精确测量）。熔解分析已使用这些新设备用于高分辨熔解曲线分析（HRM或HRMA）。基于它的易用性、灵活性、低成本、非破坏性、高灵敏度和特异性的特点，高分辨熔解曲线分析已成为筛选病人致病突变的首选工具。这里我们将简短地讨论高分辨熔解曲线分析目前的发展，特别回顾它在其它方面的应用，包括前序列筛查，单核苷酸多态性分型，甲基化分析，定量（拷贝数变异和镶嵌性），替代凝胶电泳和克隆。总之，这些不同的应用使高分辨率熔解曲线分析成为了一种多用途的技术和标准，可用于任何核酸研究的实验室中
关键词：突变筛查；甲基化；熔解曲线分析；HRM；HRMA
硬件
有几个供应商生产高分辨熔解曲线分析系统（HRM或HRMA）。整体而言，这些系统能达到预期的结果，但是差异很大[Herrmann et al.,
2006,
2007]。目前可用的灵敏度最高的系统是HR-1(盐湖城市，由他大学，爱德华科技有限公司)，荧光信号产生于55—95℃，温度以0.1℃/s升降，200个数据点/℃。一些实验，例如，多个SNP测定[Seipp
et al.,
2008]，关键取决于这个分辨率。HR-1使用玻璃毛细管每次分析一个样品；其它玻璃毛细管系统可分析32个样品。微孔板系统更受欢迎、使用方便，可同时分析96或384个样品。另一个区别是系统是否仅用于高分辨率熔解曲线分析或是否是PCR结合高分辨溶解曲线分析的设备。Rouleau等很好地证明了定量PCR结合HRMA设备在同一个实验中可以用于定量（缺失/重复）和定性（核苷酸）的改变。
在大多数系统中小的板孔之间的温度差异影响灵敏度。Seippet al.
[2007]通过增加控制温度的低温和高温温度校准探针避免这个问题。分析软件可以利用探针的熔解位置弥补板孔之间的温度差异，减小Tm标准偏差38%，显著地提高了灵敏度。值得注意的是，高分辨熔解曲线分析软件的使用决定最终灵敏度的重要因素[Herrmann
et al.,2007]，但并不是所有的软件包有利于温度校准探针的使用。
LC-Green是第一种可用的饱和染料[Wittwer
et al.,2003];目前，已有多种饱含染料。包LCGreens1(IdahoTechnology Inc.), Syto9s
(Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreens (Biotum) 和LightCyclers 480
ResoLight Dye (Roche,
Indianapolis,IN)。价格差异很大；所有的饱和染料都有一些差异，它们对PCR缓冲液和反应条件要求略有不同。
高分辨熔解曲线分析的完成非常简单。最简单的设置，不需要对现有条件修改，添加染料后进行PCR熔解。这个简单方法允许我们，例如很快的区分apoE等位基因的所有可能情况（Fig.1A）。ApoE使用其它分型技术存在许多问题，主要是要求每个等位基因区分开。最后，高分辨熔解曲线分析是一个闭管实验，染料在PCR反应前加入更好。如果实验要求改变PCR条件，通常可以增加镁离子浓度2-3
μL，退火温度增加1-5℃。当镁离子浓度升到设备的最大温度以上时，加像二甲基亚砜（10%）或犊牛血清（0.5M）可以降低Tm值。对于复杂的实验，使用梯度PCR仪可以快速的确定最佳的退火温度。
高分辨率熔解曲线分析在不同实验室不要求有大的改变，同时也不要特别的技术；它是在有特殊染料存在的条件下PCR条件过程进行小的修改。最昂贵的是设备的购买。在10,000-50,000欧元之间，根据系统，甚至其它一些技术相比它并不逊色。因为高分辨率熔解曲线分析不像许多其它技术（例如，SSCA，DHPLC，DGGE,或毛细管电泳），不需要PCR后分离，更重要的是节省成本。此外，高分辨熔解曲线分析是一个非破坏性的技术，同时可以进行后续的分析，比如，熔解分析后进行凝胶电泳或测序。
图1.使用高分辨熔解曲线分析检测序列突变。A：检测所有六个可能的ApoE等位基因组合；PCR后高分辨熔解曲线分析前添加LC-Green+染料（PCR包含10%DMSO）。ApoE 3/3等位基因作为标准（水平的灰线）。B-D：使用氨基封闭的非标记探针检测MBL2基因第一个外显子的3个独立突变(Roos et al., in preparation)。B：衍生图全图；C:放大的低熔解探针和D：（PCR片段）Tm峰。使用熔解图10种等位基因可以清楚地区分。
