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多个序列突变的筛查-HRMA（三）

2020.7.13

前序列筛查

使用HRMA进行前序列筛查，特别是对于大基因可以节省很大的成本；Provaznikova 等[2008]报道对于MYH9基因可以避免85%的测序。在例中的DMD基因，第79个外显子需要分析(Al-Momani 等)，假定每个外显子测序需要10欧元，筛查一个患者总共需要800欧元。每个外显子PCR花费1欧元，HRMA染料花费0.1欧元，每个患者估计花费90欧元。假定序列分析需要5个外显子熔解需要分析（包括一个致病突变，三个非致病突变和一个假阳性）需要增加50欧元，总花费为140欧元。每名患者将节省650欧元，当使用熔解探针去确定常见非致病突变存在时，将会减少更多的花费。事实上，基于这些图，五个外显子基因的HRMA预筛查已经很划算。此外，检测体细胞的变化或异质性[Dobrowolski 等.2009],HRMA比测序似乎更灵敏。

SNP分型

HRMA用于SNP分型有很大的吸引力。实验设计廉价、简单、速度快。当在一个特定区域设计一到两个PCR覆盖一个SNP，至少一个通常两个将得到很好的结果。提高灵敏度，片段必须够小（80-100bp），当可以选择时（比如：在单倍体中）应选择G-A突变（预计得到最大的熔解变化）[Reed 和Wittwer, 2004]。推荐添加非标记探针[Nguyen-Dumont 等, 2009; Zhou 等,2008]，得到了双重检测同时提高了纯合子突变检测率。当设定的引物到达时，不用做一到两次的 PCR去摸索扩增条件。检测成本仅仅PCR费用，实验设计花费可以忽略。除非有大量的样品需要分型，染料成本相对于实验成本包括具体的标记探针（例如，TaqMan）而言比较低。HRMA样品吞吐量可以通过使用自动进样板增加，在一些系统中可用一些延伸或安装一个附加的进样器。
根据上面描述的阳性结果是否重复可变数目，特别是CA重复，可以被HRMA分型（图4）。虽然样品所有的熔解曲线可以清楚地被区分，我们发现所有可能结合的等位基因很多，所以杂合子CA重复分型不能准确确定。可以通过小的家族去检测家族成员间的差异同时研究杂合子样品的杂合性（LOH）缺失。正如Intemann等[2009]的实验结果，可以推测熔解探针的添加跨越最小的或最大的等位基因可以更大的增加分辨率。
HRMA的一个缺点是不能轻易应用使用多重模式，同时进行几个不同片段同时分型突变。按理来说，可以利用颜色差异，温度差异完成多重模式。Seipp等[2008]利用最简单的方法，Tm差异成功地设计了一个四倍体基因分型实验。然而，这些设计时间多少和成功决定于高质量的DNA样品和HRMA系统的灵敏度使用。

图4. 使用HRMA分析CA重复。六个不同DNA样品重复分析，所有的都是杂合子。上图：归一化温度变化熔解3=14/17,4=14/18,5=15/21,6=14/21。

甲基化

目前，基因组研究经常涉及表观遗传学标记，尤其是CPG二核苷酸在基因表达、印记和肿瘤的甲基化(Ehrich等2006)。这些程序关键的步骤是基因组DNA的处理，不断改变的非甲基化C核苷酸（不是甲基化Cs）到我们。HRMA可以应用在这些研究中的两个阶段。首先，成功治疗的前后可以通过控制的基因组片段的PCR检测，没有甲基化的CPGs和100%甲基化样品样品的熔解曲线。越接熔解图近类似于片段100%的转变，治疗后越好[Worm等.2001]。其次，HRMA可以用于确定C-U转变的百分率，直接用于熔解探针的结合[Maat等.2007]或克隆后。

量化— 确定镶嵌性和拷贝变异数量

根据熔解曲线变化,HRMA可以用于量化分析；较大的变化、较小的差异可以被检测到。确定突变分子数量常用的技术为双氧法测序（分辨率下限为20-30%）和焦磷酸化测序法（下限为1-10%）。虽然功能强大，焦磷酸测序法是一种劳动密集、昂贵同时需要专门设备的方法。我们成功的应用HRMA确定不同等位基因的数量[Aten等, 2009; Bruder等, 2008]，同时显示检测12.5%的步骤（1/8）通常是可以的[Aten等2009]。结肠癌中体细胞检测的应用见图5。使用稀释系列作为一个标准，可以快速确定三个疑似携带致病突变患者的体细胞嵌合体水平达5-10%。这些数据和通过焦磷酸测序获得的结果完全吻合[Hes等,2008]。然而检测费用低廉同时易于操作。应当指出当使用熔解探针时分辨率会提高到5%以下。等位基因表达差异确定的其它应用，基于突变在mRNA中的存在和mtDNA杂合子的检测[Dobrowolski等, 2009]。

图5.使用HRMA量化。A:在APC第8外显子非致病突变A>G稀释系列。B：三个马赛克样品的HRMA曲线。下图：衍生图。等位基因长度为：1=18/21,2=17/21 图像重叠（S1-S3）和体细胞嵌合体水平的估计。样品的焦磷酸测序估计分别为：30%、19%和7%

目前，我们使用相同的方法研究一对双胞胎细胞携带体细胞缺失的片段。[Bruder等, 2008]。当筛查患者基因组改变相关疾病时，采用该方法也可以用于确认CNVs（缺失和重复）。根据不同的设置，像FISH、MAPH [Armour等, 2000], MLPA [Schouten等, 2002], MAQ [Suls等, 2006], 和 qPCR 技术可以用于确认阵列结果。然而这几项技术要么成本昂贵要么需要进一步的发展。任何可疑区域的SNP都可以使用HRMA确认。这些纯合子样品对于的等位基因（AA和BB）和潜在的携带变化的样品1﹕1混合。假定检测样品携带了A等位基因，要么是AO,要么是AA。当与纯合子BB样品1:1混合，缺失确定时，熔解图样品AA:BB以1：2的比例混合（AOBB）。当样品AA:BB以1：1比例混合时，缺失不存在（AABB）。当1：1纯合子样品BB样品与3：2 AA: BB样品混合（AABB）。

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周锦帆