食用合成色素的测定（三）

2020.3.18

Rf(比移值)=斑点移动距离/溶剂前沿距离

　　所使用的展开剂有：

　　1)正丁醇︰无水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3

　　2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4

　　3)异丁醇︰无水乙醇︰水 = 3︰2︰2

　　⑼ 提纯色素溶液的薄层分离和定量

　　经过纸层析定性之后，含有一种色素的样液定容之后，离心即可定量;含有两种以上的复合色素的样品溶液，需要经过薄层分离为单色素后，再用比色法分别定量，测定出各种色素的含量。

　　具体步骤是：薄层板制板→点样层析→比色→标准曲线绘制→计算含量

　　1) 薄层板制备

　　聚酰胺粉1g于研钵中→加15ml 75%甲酸→搅拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅胶G→研磨1分钟→立即涂板(玻璃板要求光滑平整，先用水洗净，干燥后用酒精擦拭干净，涂板时可用涂本器或手工玻璃涂布)→可涂15×10厘米玻璃板三块(厚度为0.25-0.3毫米)→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→盖好盖子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小时→取出玻璃板→于空气中风干→于60-65℃烘箱30分钟→放入干燥器中备用

　　2) 点样层析

　　用点样管(毛细管、微量注射器)将浓缩并定容的样液点在薄层板上→基线距底边2厘米→点成与底边平行的条状→两端距边各为2厘米，点样量一般为0.4ml→点样时要用电吹风机边点边吹干→然后进行展层析

　　展层缸先用溶剂系流30分钟→再把点好样的薄层板放入展析缸用上行法展开→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大约1小时看色素已明显分开后→即可取出薄板→晾干

　　对溶剂系流的选择是：a) 分离胭脂红、苋菜红、新红、柠檬黄、桔黄、靛蓝等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4(这种展开剂主要分离靛蓝，因为靛蓝上升很快，其它上升很慢);b) 分离柠檬黄、胭脂红、苋菜红、柠檬黄、桔黄等时用展开剂为2.5%柠檬酸钠︰氨水=4︰3(柠檬黄上升很快，其它上升慢);c) 对于分离两种红色素(苋菜红、胭脂红)的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4(主要是苋菜红与胭脂红上升快，其它色素上升慢)。

　　3) 比色定量

　　将薄层板展开后→用小刀分别将各条色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽滤→于水浴上蒸发到无氨味→定容10ml→分别测出消光值E(根据各种色素的最大吸收波长测定其光密度)→从标准曲线上查出相应的各色素含量.

　　4) 标准曲线的制备

　　先配成标准色素贮备液(100微克/ml)，称0.1g标准色素加水稀释至1000ml

　　10ml比色管 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

　　标准应用液 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

　　加水分别加水至10ml

　　相当于μg/ml 0 1 5 10 20 30 40 50 60 70

　　分别测出EO-E9的消光值以水为参比，以色素浓度为横生标，消光值为纵坐标，绘制标准曲线。以水为参比，pH值为6，各色素的最大吸收波长为下：

　　胭脂红 508纳米;柠檬黄 428纳米;苋菜红 520纳米;

　　晚霞黄 485纳米;赤藓红 528纳米;靛蓝 610纳米;

　　注意事项

　　1) 上述两个公式若乘以1/100，即由mg/㎏变为几/万。例如胭脂红含量为80mg/㎏即0.8/万;2) 聚酰胺粉吸附要求预先活化，并要求在一定的温度、pH和一定的作用时间下进行，操作时要注意。聚酰胺在酸性条件下吸附色素牢固，用水洗涤聚酰胺粉以除去可溶性物质，要求水偏酸性(pH=4)，防止聚酰胺上色素在洗涤过程中脱落下来;

　　3)样品的前处理和提纯过程很重要，要充分去除杂质(油脂、蛋白质、淀粉、糖)以免影响吸附及层析效果。

　　一般能溶解在水中的物质，如食盐、糖、味精、香精等，在用酸性水洗涤聚酰胺粉时都能除去，还有明胶、果胶也可以通过大量水除去;对油脂类可以用丙酮或石油醚洗涤脱脂，如果油脂含量很高，可在研钵中用丙酮、海砂研磨除去;对于样品中蛋白质、淀粉含量高时，可用蛋白酶或钨酸钠、淀粉酶水解后除去;对于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去;

　　4) 纸层析定性时不可皱折，边缘应剪齐，不可有毛边，而且要注意纸的横、竖向，应顺纹上行，展开较好，否则结果不规律;

　　5) 在浓缩样液时应控制水浴温度70-80℃，应使缓慢蒸发，勿溅出皿外，防止色素干结在蒸发皿的壁上(应经常摇动蒸发皿);

　　6) 靛蓝褪色由深兰色→浅兰色→黄色→无色。靛蓝褪色是由于光、氧、温度高、PH等多种因素的影响，测定靛蓝时要注意上述因素的影响;

　　7) 展开剂使用时最好2天换一次，以保证分离效果，放置时间过长造成浓度和极性都起变化，影响分离效果;

　　8)漏斗用完后要洗净，先用浓HCl20ml少量多次洗，然后用水多次冲洗，否则影响下一个样品的吸附或解吸作用;

　　9) 聚酰胺粉可回收使用。使用过的聚酰胺收集于干净的烧杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24小时之后水泵抽干，倒回烧杯，加0.1N HCl泡30分钟，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃烘箱烘干备用;

　　10) 比色时样液要求清晰，若混浊使E增大，影响结果，如果混浊可离心也可放置。

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