胰岛素的鉴别及检查方法
鉴别
（1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
（2）取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液（pH 7.3）20μl、0.1%V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH 2.3）－乙腈（90：10）为流动相A，乙腈－水（50：50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。
时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
0 | 90 | 10 |
60 | 55 | 45 |
70 | 55 | 45 |
检查
相关蛋白质
取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含3.5mg的溶液，作为供试品溶液（临用新制，置10℃以下保存）。照含量测定项下的色谱条件，以含量测定项下0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH 2.3）－乙腈（82；18）为流动相A，乙腈－水（50：50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。调节流动相比例使胰岛素峰的保留时间约为25分钟。取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按蜂面积归一化法计算，A21脱氨胰岛素不得大于5.0%，其他相关蛋白质不得大于5.0%。
时间（分） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
0 | 78 | 22 |
36 | 78 | 22 |
61 | 33 | 67 |
67 | 33 | 67 |
高分子蛋白质
取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法（2010年版药典二部附录ⅤH）试验。以亲水改性硅胶为填充剂（3～10μm）；冰醋酸－乙腈－0.1%精氨酸溶液（15：20：65）为流动相；流速为每分钟0.5ml；检测波长为276nm。取胰岛素单体－二聚体对照品（或取胰岛素适量，置60℃放置过夜），用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含4mg的溶液，取100μl注入液相色谱仪，胰岛素单体峰与二聚体峰的分离度应符合要求。取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。除去保留时间大于胰岛素峰的其他峰面积，按峰面积归一化法计算，保留时间小于胰岛素峰的所有峰面积之和不得大于1.0%。
干燥失重
取本品约0.2g，精密称定，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过10.0%（2010年版药典二部附录ⅧL）。
锌
取本品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液。另精密量取锌单元素标准溶液（每1ml中含锌1000μg）适量，用0.01mol/L盐酸溶液分别定量稀释制成每1ml中含锌0.20μg、0.40μg、0.80μg、1.00μg与1.20μg的锌标准溶液。照原子吸收分光光度法（2010年版药典二部附录ⅣD第一法），在213.9nm的波长处测定吸光度。按干燥品计算，含锌量不得过1.0%。
细菌内毒素
取本品，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含5mg的溶液，依法检查（2010年版药典二部附录ⅪE），每1mg胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。
微生物限度
取本品0.2g，依法检查（2010年版药典二部附录Ⅺ J），每1g中含细菌数不得过300cfu。
生物活性
取本品适量，照胰岛素生物测定法（2010年版药典二部附录ⅫG）试验，实验时每组的实验动物数可减半，实验采用随机设计，照生物检定统计法（2010年版药典二部附录Ⅺ V）中量反应平行线测定随机设计法计算效价，每1mg的效价不得少于15单位。
