底物浓度对酶促反应速度的影响——米氏常数的测定
实验原理
酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：
式中，v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；
V──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；
［S］──底物浓度（mol/L）；
Km──米氏常数（mol/L）。
这个方程表明当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01～100mmol/L。
Linewaeaver―Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测Km值的最常用的简便方法：
于是实验时可选择不同的［S］，测对应的v；
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver―Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。
试剂和器材
一、试剂
10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：分别取10、20、30、40g酪蛋白溶于约900mL水中，加 20mL 1N NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1N HCl 或 1N NaOH调pH至8.5，定容至1L，即生成四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。
中性甲醛溶液：75mL分析纯甲醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1M NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。
0.25%酚酞加50%乙醇溶液：2.5g酚酞以50%乙醇溶解，定容至1L。
标准0.1M NaOH溶液。
二、材料
胰蛋白酶溶液：称取2g胰蛋白酶溶于50mL蒸馏水中，放入冰箱保存。
三、器材
50mL三角烧瓶（×16），150mL三角烧瓶（×4）；吸管5mL（×1），10mL（×5）；量筒 100mL（×4）；25mL碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。
操作方法
1．取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。
2．量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37℃保温
10分钟，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10
滴酚酞；以0.1M
NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH
mL数。
3．在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗去 NaOH mL数。
以滴定度（即耗去的NaOH mL数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。
然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与Km值。
注意事项
（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。
