应用非标记探针法进行基因分型（四）
外显子10和11：多重突变热点
MEN2A和FMTC的主要突变位于外显子10（密码子609、611、618和620）和11（密码子630和634），且野生型半胱氨酸的密码子DNA序列“TGC”发生单核苷酸改变。外显子10和11报道的序列变化>40（表1）。
RET10外显子的主要实验包括两个单独的实验和两条探针。WT10A探针覆盖了密码子611和609，WT10B探针覆盖了密码子618和620（图1a）。所有密码子618和620突变的样品在WT10A探针下有野生型序列且有和野生型对照样品的Tm值相同（图1b）。五个密码子609和611样品中的每一个都含有一个突变等位基因，比野生型等位基因的熔解温度要低。相反的，WT10B探针，密码子609和611突变样品的Tm值和野生样品的相同，但是每10个密码子609和611突变样品有一个突变等位基因，熔解温度比野生型等位基因低（图1e）。外显子10所有的RET序列变化通过用高分辨率熔解曲线分析的标准化熔解曲线，派生图或荧光信号的不同数据（图1、c、d、f和g；数据没有显示）来检测。这些数据证实了不在非标记探针下的突变可以用扩增熔解数据检测出来（例：图1中比较蓝色突变的痕迹，b对c）。
图1：检测RET外显子10序列变化的主要实验。a：RET10外显子10的图示，红色方块显示密码子609和611，蓝色的方块显示密码子610和620。外显子10的主要实验用WT序列的两个非标记探针。如图所示，WT10A探针检测密码子609和611突变，反之WT10B检测密码子618和620突变。每个图中，显示一式两份三个野生型对照（WT，黑色痕迹），及一式两份（红色痕迹）两个密码子609和三个密码子611突变样品、五个密码子618和620突变（蓝色痕迹）。3个左面的图是WT10A探针反应的非标记探针和扩增子的高分辨率熔解数据，右面的3个图是WT10B的数据。对于每个探针，最厚重的痕迹线与探针检测的突变一起使用，稀疏的痕迹线只于扩增子检测的突变一起使用。b：WT10A探针数据的派生熔解图。等位基因分为两个Tm范围，且每个范围有预测的密码子突变等位基因（609/611突变或618/620突变），与WT等位基因一起列出。c：WT10A探针与WT主要实验和标记的外显子10突变样品的扩增派生熔解曲线。d：同样扩增数据的不同平面图。e：WT10B探针的数据的派生熔解平面图。等位基因分为两个Tm范围，且每个范围有预测的密码子突变等位基因，
与野生型等位基因一起列出。f：WT10B探针与野生型主要实验和标记的外显子10突变样品的扩增派生熔解曲线。g：同样扩增数据的不同平面图。
在主要实验中用野生型探针识别每个探针下的野生序列，样品Tm值与野生型对照等位基因Tm值相差±0.25℃（表3；补充表1；http://jmd.amjpathol.org）。RET序列变化的样品有一个等位基因，其Tm值小于野生型等位基因，△Tm值>0.25℃。限制在第二次实验中基因分型需要的特定突变探针的数目，△Tm值范围用于安装相似的△Tm值分组RET序列变化。△Tm值值的范围用于快速生成Tm标线，视觉上选择第二次试验探针。例如：图2a的WT10B探针数据显示13个样品通过Tm标线，视觉上分为一个野生型组和两个突变组。第一个突变组，包含密码子618或620的TAC、TCC、TTC和TGG，△Tm值在3.3℃到5℃的△Tm范围内（图2a；表3；补充表1；http://jmd.amjpathol.org）。这一组的样品在第二次实验中MS10B的探针集1需要4个探针（图2，b-e）。第二个突变组，包括密码子618和620的
AGC、CGC和GGC突变，△Tm值在0.25℃到3.3℃的△Tm范围内。这个突变组在第二次实验中MS10B的探针集2需要3个探针（图2，f-h）。相同的方法用于包含密码子609和611突变的WT110A探针数据（表3；补充图1；补充表2；http://jmd.amjpathol.org）。外显子10的主要实验用的△Tm值来自于两个外显子10的野生型探针限制来自28至≤8基因型未知突变的可能基因型。
为了减少第二次实验中基因分型突变所需的探针的数目，外显子10的每个特定突变探针在致病密码子范围有相同的序列改变（表2）。一个致病密码子的补充突变等位基因导致与探针只有一个错配，且Tm值比有两个错配（表2，b-h）的野生型等位基因高2℃-5℃ 。如果突变在不同的位置，突变等位基因与探针有三个错配，且熔解Tm值低于野生型（例，图2 TGG突变，b-d，粉色痕迹）。如果突变与探针序列改变在同一位置，但是不与探针互补，此时突变等位基因的Tm值接近于野生型等位基因的Tm值，因为这个等位基因与探针有两个错配。分析时，如果与野生等位基因熔解曲线不相同，这些突变等位基因因为熔解曲线相似而被遮蔽（如：图2g遮蔽的AGC和GGC，红色和灰色的痕迹）。偶尔，一个突变等位基因和非互补特定突变探针会显示比预期高的遮蔽熔解。例如：密码子618（TGC→TCC）和620（TGC→TCC）突变比野生等位基因和MS618/620TAC和TTC探针（图2， b和d，橙色痕迹）较稳定（△Tm-1.7℃至-2.0℃）。即使如此，两个杂合TTC突变通过与互补MS618/620TCC探针（△Tm-4.7℃）的较高的Tm值而容易区分（图2c，橙色痕迹）。
不管突变的位置在哪，在探针下的致病密码子的同样的突变序列改变与主要探针数据的派生熔解图非常相似（图1和2a；补充图1a；http://jmd.amjpathol.org）。比如说，密码子618（TGC→TAC）和620（TGC→TAC）突变通过主要的非标记探针或扩增子熔解曲线彼此不能区分。另外，设计的第二次特定突变探针只决定突变的序列，不识别突变的密码子位置。第二次实验中包括了检测外显子10序列变化的一个位置探针，识别突变的密码子。“L10B 620 mask” 位置探针，设计时含有一个遮蔽，在密码子620位置上的野生探针序列有3个核苷酸（密码子）缺失（表2），用于区分密码子618和620突变。密码子620突变等位基因与野生型等位基因的Tm值相似，所以被屏蔽，反之，610密码子突变等位基因的Tm值低于野生型（图2）。位置探针允许外显子10特定突变探针设计与两个分析的密码子的序列的改变相同，因此减少了第二次实验所需的特定突变探针的数目的1/2。任何被主要实验检测到的外显子10的突变只用一个位置探针和三至4个特定突变探针进行基因分型。
