应用非标记探针法进行基因分型（七）
一般来说，用特定突变探针产生1/3结果。首先，当突变序列与特定突变探针互补时，突变等位基因的熔解Tm要高于野生型（△Tm为-2℃至-5℃）。第二，当突变在相同位置但是与特定突变探针序列不互补时，突变等位基因被野生型等位基因相似的Tm值及稳定性所遮蔽（野生型等位基因Tm±0.5℃）。在这种情况下，没有互补的突变及野生型等位基因与探针在同一位置有一个错配，但是错配的精确的核苷酸形式是不一样的。遮蔽等位基因Tm值与野生型等位基因Tm值的接近程度取决于错配序列，其它与探针错配的数目及互补核苷酸周边的环境。例如：A::G错配突变等位基因比A::C错配野生型等位基因熔解温度高2℃（表2b，TAC突变和MS618/620TCC探针）。不管突变密码子序列改变在RET密码子618、620或609（611不能用于测试），结果都适用。第三，当突变在特定突变探针序列改变的不同位置，突变等位基因和探针有另一个错配且熔解Tm值低于野生型等位基因（△Tm为0.5℃至5℃）。如果从第二次实验选择的探针集内的特定突变获得结果，序列变化在探针下的突变位置未知，不能基因分型。在第二次实验中没有进行基因分型的样品需要测序（比如：外显子11密码子631序列变化）。
用遮蔽技术设计了6个探针用来简化复杂范围的分析。遮蔽技术在选择的序列变化的位置人工错配，使探针其它突变的分析变得简单。主要实验的外显子13遮蔽探针（遮蔽
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769）和外显子13的两个特定突变探针在密码子769（CTT→CTG）多态位置有一个核苷酸缺失，这可以清晰的检测和基因分型密码子768（GAG→GAC和GAT）的两个突变。外显子10和11的3条位置探针分别用三个核苷酸的缺失（密码子）来遮蔽一个致病密码子范围。位置探针用来鉴定探针下突变密码子的位置，减少了第二次实验中需要的特定突变探针的数据的1/2。
可能已知RET突与其它已知或未知突变是顺或反的意思，比如说在外显子14（密码子804和806突变）或外显子13（密码子791突变与密码子769多态）。对于探针数据，如果两个核苷酸在同一等位基因上改变，预期其Tm值低于任一突变。如果核苷酸在相反的等位基因改变，这两个等位基因的Tm值低于野生型，样品似乎是纯合突变。在这两种情况下，样品需要测序，因为任何一个变化的等位基因不在预测的RET突变的△Tm范围内或在第二次实验中没有识别基因型。如果第二个核苷酸改变不在探针下但是在扩增子之内，可以从RET突变基因分型的探针数据看到一个独特的扩增子派生曲线形状或低的Tm值便宜。这种情况很可能是外显子13（例：密码子791突变和密码子769多态）。当用外显子13扩增数据分析外显子13主要探针实验不能分析的稀有突变时，需要考虑由探针数据决定的普通密码子769（CTT→CTG）多态的存在。如果样品是WT13探针数据确定的野生型序列，如果扩增曲线从野生型对照偏移，应该测序样品检测稀有突变。如果WT13和Mask
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探针数据显示普通密码子769（杂合或纯合）多态，如果扩增曲线从769多态对照熔解曲线上偏移，需要测序样品。虽然非常稀有，RET突变可以是纯合的。如果这样的话，两个等位基因可以与合适的特定突变探针互补。
表1列出的是已报道的用RET基因分型实验分析的外显子10、11、13、14和16的MEN2突变、多态和序列变化。外显子15和8及最近报道的外显子5的没有包括的极其稀有的MEN2突变，可以通过测序这些外显子进行基因分型。表1列出的外显子11密码子631序列变化期望和测试的密码子631（GAC→GAT）样品有相同的结果：主要实验的缺失，第二次实验没有基因分型的，需要测序基因型。病人和一般群体的两个普通RET多态没有分析，因为其没有引起MEN2综合症：外显子14p.S836S（3%至10%的等位基因频率），外显子11p.G691s（17%至28%等位基因频率）。引物选择排除外显子11密码子691多态，反之外显子14多态选择探针时排除。在一个反应中用两个探针检测所有的已知外显子14密码子836多态周围的突变，没有检测多态性。密码子836多态性的外显子14扩增熔解曲线与一个突变有相似的Tm值及派生熔解曲线，且不能区分。因此外显子14扩增数据不能分析，因为可以检测密码子836多态但是不能和突变区分，产生了不必要的测序步骤。
在RET原癌基因内的其它报道的序列变化，引起先天性巨结肠症（HSCR）疾病而不是MEN2，也可能是新的突变。主要实验探针检测的新的突变或HSCR突变不能用第二次实验中的MEN2特定突变探针进行基因分型，需要测序。扩增熔解数据检测到的新的突变或HSCR突变需要测序进行基因分型。这些事件非常不寻常，因为MEN2和HSCR有不同的临床表现。虽然如此，有报道外显子10密码子618（TGC→CGC）和620（TGC→CGC）的突变引起MEN2和HSCR。另外，外显子10密码子609（TGC→AGC和TGG）和密码子611（TGC→TCC）与HSCR有联系，而不是MEN2。随着RET基因分型实验的发展，在目的外显子的任何序列都可以基因分型，且可以根据基因型确定合适的方法。
总的来说，RET基因分型实验有两步PCR，主要实验和第二次实验。设计主要实验以便野生型外显子基因分型，区分多态性（或从实验中去除），扩增熔解数据可以检测稀有突变，普通突变用非标记探针法或扩增熔解数据来检测，不需要测序。第二次实验用限制数目的特定突变探针基因分型RET突变。这两步实验检测和基因分型盲实验中所有RET野生型、突变、多态和序列变化样品，精确度100%，用时少于测序这5个外显子的时间的1/2。
RET基因分型实验可用于其全部的位置或有嫌疑的RET突变，当RET突变在家族中是已知的，通过单个外显子，或用一个特定突变探针（位置探针，如果需要的话）进行分型。
