应用非标记探针法进行基因分型（六）
外显子14：多重探针分析
主要实验的外显子14，
两个野生型的探针同时用于一个反应，用来检测所有已报道的外显子14的突变，同时消除密码子836（p.S836S）多态性（图4；a和b；表3；补充表5；http://jmd.amjpathol.org）。WT14A探针在65℃-76℃检测密码子804和806突变，反之，WT14B探针在76℃-85℃检测密码子844和852序列变化。WT14A主要探针检测的序列变化，第二次基因分型实验用3个特定突变探针（MS14A探针集1；图4；c-e）。例如：密码子804（GTG→ATG）突变等位基因通过比野生型等位基因高的Tm值基因分型。野生型等位基因与MS
480 ATG探针（表4c）互补且被不互补的MS 804 TTG和
CTG探针遮蔽（图4，d和e）。除了不互补遮蔽之外的所有需要检查的密码子480突变等位基因，特定突变探针与野生型等位基因有相同的Tm值。设计MS
844 CTG和MS 852 ATG这两个探针，来检测在主要WT14B探针下的已知序列变化（没有显示数据）。
外显子16：主要特定探针
因为95%的MEN2B事例有RET外显子19密码子918（ATG→ACG）突变引起的，外显子16主要实验用一个特定突变的探针，密码子918突变等位基因的Tm值高于野生型等位基因（△Tm-5.6；表4f），扩增子数据证实从野生型控制偏移（没有显示数据）。密码子922序列变化，在探针下，密码子912稀有突变在扩增子之内，不能用于测试。
图4：外显子14和16内的突变的基因分型。a：在一个反应中的两个野生型外显子14主要实验探针数据生成的派生熔解曲线图。WT14A探针数据的温度范围是65℃-76℃，WT14B探针数据的温度范围是76℃-85℃。一式两份显示三个野生型对照（黑色痕迹）、密码子804（GTG→ATG）（深灰痕迹）（GTG→TTG）（浅灰痕迹）两个杂合突变样品。密码子804（GTG→TTG）突变不可用。图表中所用的颜色是一致的。显示标记的突变等位基因（MUT）和WT等位基因的派生熔解温度范围。b:用材料和方法描述的额外的标准化和指数背景移动，数据与a相同。c-e：和b一样的分析图。第二次实验中用MS14A探针集1中的三个探针检测突变样品：MS 804 ATG （c），MS 804 TTG（d）和MS 804 CTG（e）。和WT等位基因一样标记互补密码子突变DNA序列，且遮蔽突变等位基因（遮蔽“密码子DNA序列”MUT）。f：外显子16密码子918特定突变探针（MS918ACG）主要实验数据的派生熔解曲线图。一式两份显示三个野生型对照（黑色痕迹）、密码子918（ATG→ACG）（灰色痕迹）两个杂合突变样品。突变等位基因与WT等位基因一起标记。
盲研究
在RET外显子基因分型实验中，测试5个野生型样品和29个可用的RET序列变化盲样品组合（补充表6；http://jmd.amjpathol.org）。在主要实验中把不同于19野生型外显子的59个RET序列变化基因分型。另外，外显子13多态样品的纯合与杂合样品，以及外显子16密码子918（ATG→ACG）突变，在主要实验中基因分型。探针和扩增子数据结果是一致的。不论第二次实验通过Tm标线选择或计算每个样品的△Tm值，之后用△Tm数据表选择特定突变集合，外显子10和11的结果相同。对于每个突变，基因分型只需2-5个探针，且不需要测序。第二次实验基因分型主要实验检测到的主要RET序列变化。虽然主要实验检测到外显子11密码子631序列变化样品，第二次实验并没有设计用于此为点基因分型的特定突变探针，且只有这些样品需要测序进行基因分型。
讨论
虽然测序是RET基因分型的标准，突变扫描是比较划算的，因为测试的大部分外显子是野生型的。检测不定时发作骨髓甲状腺癌病人的RET突变，然而实际上只有10-25%的病人有生殖细胞RET突变。此外，因为MEN2是常染色体显性紊乱，MEN2患者在一个外显子有一个RET突变，其它外显子是野生型（或有多态）。MEN2病人的亲属一般测试RET突变且可能在一个外显子有突变或所有测试的外显子都是野生型。假设33%的测试MEN2突变的病人实际上在检测的5个外显子中有一个外显子有一个RET生殖突变，则测试的外显子的93%是野生型或不致病多态基因型。
扩增子高分辨率熔解分析可以检测100%的RET序列变化。虽然扩增子高分辨率熔解分析可以区分独特的杂合子，但是很多RET基因型不能区分出来，因为不同的序列变化有相似的扩增熔解曲线。添加非标记探针可以在相同的熔解数据上分析扩增子及探针数据。但是，有一些RET突变在野生型非标记探针存在反应的情况下仍不能区分。比如：RET突变
“TAC”可以在密码子618或620中发现，每个突变导致差不多的探针熔解，因为野生型探针覆盖两个突变，且最近的碱基是相同的。
为了用最小数目的非标记探针及反应完成RET突变的基因分型，发明了一种连续的两步法，包括主要实验和第二次实验。主要实验通过扩增子熔解检测引物间的突变，用非标记探针法分析RET突变热点。主要实验用到的大部分探针式野生型序列。外显子特定突变探针是个例外，其与密码子918普通
MEN2B突变互补（95%MEN2B情况）。另外，用遮蔽技术设计的主要外显子13探针用于明显的区分普通密码子769（CTT→CTG）多态和密码子768突变。在主要实验中，用7个PCR反应和8个探针，讲RET外显子（93%）大多数基因分型为野生型。这个主要实验同时也基因分型外显子16密码子918（ATG→ACG）突变。
用已发布的每个MEN2综合症密码子突变的频率及每个MEN2综合症的平均发生率来评估主要实验探针检测的RET突变的百分率：MEN2A，75%；FMTC，20%；MEN2B，5%。外显子10、11、13、14和16的探针检测已报道的MEN2突变的98%。外显子MEN2A和FMTC突变主要在密码子634，且MEN2A病人最普通的突变在密码子634（TGC→CGC）,其频率为50%。在探针分析区域之外有稀有突变（表1），这些突变只通过扩增子熔解分析检测，之后进行测序。第二次实验用于基因分型主要实验探针检测的RET序列变化。PCR反应的第二步需要由主要实验探针数据选择的2至4个特定突变探针，基因分型每个样品。外显子10和11需要位置探针检测密码子的突变，因为外显子10和11的特定突变探针在每个致病密码子上有相同的突变核苷酸改变。只由扩增熔解分析检测到的稀有序列变化，或主要探针检测到的序列变化没有被第二次实验探针进行基因分型的突变均需要测序，需要测序的RET外显子少于0.2%。
