食品检测--麻痹型贝类毒素检验方法
一、样品制备
①蛤蜊、牡蛎、贻贝和扇贝 用清水将贝壳外表彻底洗干净,切断闭壳肌,开壳,用清水冲洗内部除掉泥砂和其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开,仔细取出贝肉,不要割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集200g 肉置于10号筛子中沥水5min(不要使肉堆积),拣出碎壳等杂物,将贝肉均质。
②贝类罐头 将罐内所有内容物(肉及液体)倒入均质器充分均质。如果是大罐,将贝肉沥水并收集沥下的液体,分别称重,将固形物和汤汁按比例混合,充分均质。
③用酸保存的贝肉 沥去酸液,分别存放贝肉及酸液,将沥干的贝肉充分均质。
④冷冻贝类 在室温下,使冷冻的样品(带壳或脱壳的)呈半冷冻状态,按①方法开壳、清洗、取肉、均质。
⑤贝肉干制品 干制品可 HCl(0.18mol/L)溶液中浸泡(冷藏),按③方法沥干、均质。
⑥试样保存 上述经均质处理的样品如不能及时检测,可取100g 已均质贝肉加入100mL HCI(0.18mol/L)溶液,置于4℃冷藏保存(尽可能及时检验)。
二、测定方法
①方法提要 本方法采用鼠单位测定,对麻痹型贝类毒素(PSP)予以定量。鼠单位定义为:对体重为20g 的小白鼠腹腔注射1mL 贝类提取液后,在15min 时杀死小鼠所需的最低毒素量。采用 saxitoxin 作为毒素的标准品,将鼠单位换算成毒素的微克数。根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间,查出鼠单位,并按小鼠体重,校正鼠单位,计算确定每100g贝肉内的 PSP 的微克数。所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的 PSP 毒素的总量。
②试剂和材料
盐酸溶液:0.18mol/L,将15mL 浓 HCl 用蒸馏水稀释至1L。
盐酸溶液:5 mol/L,将41.7mL 浓 HCl 用蒸馏水稀释至100mL。
氢氧化钠溶液:0.1mol/L,将4.6g NaOH 溶于1L 蒸馏水中。
麻痹性贝类毒素(saxitoxin)标准液:10μg/mL,经酸化,含有20%的乙醇作为保护剂,冷藏时,无限期稳定。
体重19～21g ICR 品系的雄性健康小白鼠。
③仪器和设备 均质器、天平(感量0.5g)、离心机、pH计、秒表、烧杯、量筒、容量瓶、搅棒、注射器(1mL)。
三、测定步骤
①PSP标准工作液的配制 用移液管取1mL(100μg saxitoxin/mL)标准液于100mL 容量瓶中,加入用 HCl 酸化至 pH 值为3的蒸馏水并定容。该液为1μg saxitoxin/mL。pH 值在2.0～4.0之间。在3～4℃下能稳定数周。分别用10mL,15mL,20mL,25mL 和30mL水稀释10mL 浓度为1μg/mL 标准液,稀释液的 pH 值应为2～4。
②中位数死亡时间的标准液选择 将系列浓度的 PSP 标准工作稀释液各1mL 腹腔注射数只小鼠,选择中位数死亡时间为5～7min 的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求,还需以1mL水的增减量补充稀释试验。例如,用25mL 水稀释的10mL 标准液在5～7min 杀死小鼠,还需要进行24+10和26+10的稀释度试验。
以10个小鼠为一组,用中位数死亡时间在5～7min 范围内的两种(最好是三种)稀释度的标准液注射小鼠。记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。
每只小鼠事先称重,精确到0.5g 记录注射完毕至死亡时间的最短间隔为5s,即7s 校正为5s,8s 校正为10s,见下表。
麻痹型贝类毒素死亡时间-鼠单位的关系
时间 | 鼠单位 | 时间 | 鼠单位 | 时间 | 鼠单位 | 时间 | 鼠单位 | 时间 | 鼠单位 |
1:00 | 100 | 2:45 | 4.26 | 4:20 | 2.26 | 6:30 | 1.48 | 12:00 | 1.05 |
1:10 | 66.2 | 2:50 | 4.06 | 4:25 | 2.21 | 6:45 | 1.43 | 12:13 | 1.03 |
1:15 | 38.3 | 2:55 | 3.88 | 4:30 | 2.16 | 7:00 | 1.39 | 12:14 | 1.015 |
1:20 | 26.4 | 3:00 | 3.70 | 4:35 | 2.12 | 7:15 | 1.35 | 12:15 | 1.000 |
1:25 | 20.7 | 3:10 | 3.57 | 4:40 | 2.08 | 7:30 | 1.31 | 12:16 | 0.99 |
1:30 | 16.5 | 3:15 | 3.43 | 4:45 | 2.04 | 7:45 | 1.28 | 12:17 | 0.98 |
1:35 | 13.9 | 3:20 | 3.31 | 4:50 | 2.00 | 8:00 | 1.25 | 12:18 | 0.972 |
1:40 | 11.9 | 3:25 | 3.19 | 4:55 | 1.96 | 8:15 | 1.22 | 12:19 | 0.965 |
1:45 | 10.4 | 3:30 | 3.08 | 5:00 | 1.92 | 8:45 | 1.18 | 12:20 | 0.96 |
③毒素转换系数的计算 计算用各种稀释液所注射的10只小鼠的中位数死亡时间。若某种稀释液注射的所有10只小鼠中位数死亡时间小于5min 或大于7min,则弃去该组结果;若另一种稀释液注射的10只小鼠中位数死亡时间在5～7min,即使某些小鼠死亡时间可能小于5min 或大于7min,也要使用该组所有数据。但是某组稀释液经注射后,10只小鼠中有3只以上存活,则要再取10只小鼠进行重复试验。
根据所选稀释液注射的10只小鼠中位数死亡时间为5～7min 之间的死亡时间,由上表分别查出鼠单位(MU),再通过资料查出小鼠的体重校正因子,两者相乘求得每毫升稀释液的校正鼠单位(CMU)。将所选稀释液每毫升实际毒素含量的微克数(以石房蛤毒素 saxitoxin 计算)除以 CMU 值便得到毒素转换系数(CF),即CF=μgSAX/CMU。
计算每组10只小鼠的平均 CF 值,再取其组间平均 CF 值,并以此为标准作常规检测。
④CF 值定期检查 如 PSP 检测间隔时间较长,每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠,重新测定 CF 值。如果一周有几次检测,则用中位数死亡时间5～7min 的标准稀释液每周检查一次。测得的CF值应在原测定CF平均值的土20%范围内。若结果不符用同样的标准稀释液另注射5只小鼠,综合先前注射的5只小鼠结果,算出 CF 值。并用同样的标准稀释液注射第二组10只小鼠将第二组求出的 CF 值和第一组的 CF 值进行平均,即为一个新的 CF 值。
重复检查的 CF 值通常在原结果的±20%之内。若经常发现有较大偏差,在进行常规检测前应调查该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。
⑤样品中 PSP 的提取 取100g 已均质的样品置于称重过的800mL 烧杯中,加100mL HCl溶液(0.18mol/L)或样品中沥得的酸液,充分搅拌,检查pH值,pH值应为2.0～4.0。若需要,可逐滴加入HCl(5mol/)或 NaOH(0.1mol/L)搅拌以防止局部碱化使毒素破坏。将混合物加热,并徐徐煮沸5min,冷却至室温,调节已冷却混合物的pH值至2.0～4.0。将混合物移至量筒中并稀释至200mL。
将混合物倒回烧杯,搅拌至均质状,使其沉降至上清液呈半透明状,直至滗析分离时不产生大至堵塞注射针头的固体颗粒为止。必要时将混合物或上清液以3000r/min 离心5min,或通过滤纸过滤。保留足以进行小鼠注射用的液体。
⑥小鼠试验 将小鼠称重并记录质量。每个样品注射三只小鼠。对每只试验小鼠腹腔注射1mL提取液。注射要准确熟练,若有一滴以上提取液溢出就须将该只小鼠丢弃,并重新注射一只小鼠。记录注射完毕时间仔细观察小鼠停止呼吸时所表明的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止),用秒表记录死亡时间。若小鼠的中位数死亡时间小于5min,则要进行稀释再注射另一组小鼠3只,以得到5～7min 的死亡时间。若注射未稀释的样品后,1或2只小鼠的中位数死亡时间大于7min,则需注射至少3只小鼠以确定样品的毒力。如需稀释样品,要逐滴加入 HCl(0.1或0.01molL),调节稀释液的pH值至2.0～4.0。
四、结果的计算与判断
①PSP 毒力的计算与判断 根据小鼠的死亡时间,在表1中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数 MU。若试验动物质量小于19g 或大于21g,则就根据表2查出质量校正系数,质量校正系数乘以该只小鼠的 MU 便得到 CMU。计算该组小鼠的中位值 CMU(将存活鼠的死亡时间视为大于60min 或相当于小于0.875MU)。以中位值按下列公式计算样品中的 PSP 毒素的含量。
μgPSP/100g肉=中位数CMU/mL×CF×稀释系数×200
任何大于80μg/100g肉的值即被认为是有害的,对人类食用不安全。
②MU毒力的计算与判断 取得麻痹性贝类毒素标准品有困难的实验室可使用鼠单位MU对检验结果予以计算与判断。按①求出该组小鼠的中位数CMU,然后求出100g贝肉的MU值。
MU/100g 肉=中位数CMU/mL×稀释系数×200
任何大于400MU/100g 肉的值即被认为是有害的,对人类食用不安全。
