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亲和层析实验

2020.8.17

实验材料 蛋白质

试剂、试剂盒 TrisTSA裂解缓冲液脱氧胆酸钠洗涤缓冲液三乙醇氨缓冲液

仪器、耗材 层析柱离心管离心机

实验步骤

1.  准备一支活化后被淬灭的Sepharose预柱(5 ml 柱床)和一支Ab-Spharose免疫亲和层析柱,并将它们串联起来。


2.  以冰冷TSA溶液重悬50 g 细胞至1~5×108细胞/ml,或往收集的细胞或组织匀浆中加入1~5倍体积的TSA。再加入等体积的冰冷裂解缓冲液,于4℃搅拌1 h。


3.  以4 000 g 离心10 min,除细胞核,轻轻倒出上清,保留之。

 

4.  对于提纯膜抗原,在去细抱核的上清中加入0.2倍体积的5%脱氧胆酸钠,于水浴或 4℃放置10 min,转移至quick-seal离心管100 000 g 离心1 h,小心移出上清并保留之。

 

5.  将预柱连接于免疫亲和层析柱。

 


图一、免疫亲和层析柱


6.  依次用下列缓冲液洗柱子:

10倍柱床的洗涤缓冲液

5倍柱床的Tris缓冲液,pH8.0

5倍柱床的Tris缓冲液,pH9.0

5倍柱床的三乙醇氨溶液

5倍柱床的洗涤缓冲液


7.  将上清(保留一些样品待分析用)上样于预柱,让它们以5柱床/h 的流速流过预柱和免疫亲和层析柱,按加样上清体积的1/10~1/100分部收集穿透液。

 

8.  用5倍体积的洗涤缓冲液洗柱子,然后关闭两根柱子的止水阀。拆离亲和柱与预柱的连接,打开亲和柱的止水阀,让柱床上面的液体流至柱床表面。


9.  依次以下列溶液洗柱子,并分部收集流出组分:

5倍体积的洗涤缓冲液

5倍体积的Tris缓冲液,pH8.0

5倍体积的Tris缓冲液,pH9.0


10.  以5倍体积的三乙醇胺溶液洗脱,将每一个柱床体积的洗脱液收集于含0.2体积的1 mol/l Tris·Cl 缓冲液,pH6.7的试管中,以中和冼脱液。

 

11.  以5倍体积的TSA溶液洗柱子。

 

12.  分析含抗原的洗脱液组分:每份洗脱液取50 μl SDS-PAGE银染分析。取0.5~ 1 ml 上柱样品和有代表性的穿透流出液及洗脱液以Ab-Sepharose免疫共沉淀,并接着进行SDS-PAGE和银染检测以确定柱子是否已被饱和。


注意事项

在每次更换缓冲液时,按下述过程洗免疫亲和柱:


1.  关闭止水阀并打开注于上端的帽子。


2.  用一注射器连接于来自缓冲液贮槽的输液管的出口处,吸去所有液体。


3.  将管子移至盛在另一贮槽中的另一种洗柱缓冲液中,用注射器抽吸,使管子充满液体,取走注射器,调整流速,并用此缓冲液冼柱子的内壁。


4.  打开止水阀,让柱子的缓冲液流至往床水平面,放松柱子的上帽让缓冲液流下到柱床以上几厘米的水平,收紧帽子,开始洗涤或洗脱。


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