银染法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒产品使用说明
主要用途
YIJI银染法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂是一种旨在通过端粒酶体外合成端粒重复序列的引物延展方法，继而进行多聚酶联扩增反应，在非变性聚丙烯酰胺电泳上，通过经典的银染技术，呈现六碱基相间的阶梯图像，以分析和评价活细胞端粒酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，染色清晰，重复性好。
技术背景
端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的体外端粒酶活性的检测技术。首先，非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增；内参引物的整合用于定量酶活性。银染技术可以检测25至50皮克DNA条带。
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 30毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 3毫升
YIJI反应液（Reagent C） 1毫升
YIJI上样液（Reagent D） 100微升
YIJI胶底液（Reagent E） 6毫升
YIJI凝结液（Reagent F） 1.5毫升
YIJI促进液（Reagent G） 200微升
YIJI胶体液（Reagent H） 60毫升
YIJI电泳液（Reagent I） 100毫升
YIJI固定液A（Reagent J） 40毫升
YIJI固定液B（Reagent K） 160毫升
YIJI染色液（Reagent L） 40毫升
YIJI中和液（Reagent M） 40毫升
YIJI显影液A（Reagent N） 300微升
YIJI显影液B（Reagent O） 300微升
YIJI终止液（Reagent P） 40毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）、YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI反应液（Reagent C）和YIJI凝结液（Reagent F）在－20℃冰箱里，YIJI上样液（Reagent D）和YIJI促进液（Reagent G）保存在4℃冰箱里；其余的保存在室温下。YIJI上样液（Reagent D）、YIJI胶底液（Reagent E）、YIJI促进液（Reagent G）、YIJI胶体液（Reagent H）和YIJI染色液（Reagent L），避免光照，有效保证6月
用户自备
无离子水：用于染色使用的浓缩试剂
200毫升烧杯：用于配制工作液的容器
1.5毫升离心管：用于细胞裂解的容器
0.5毫升PCR管：用于扩增反应的容器
15毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
50毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制和溶液混匀的容器
DOUNCE匀浆器：用于组织裂解
PCR仪：用于扩增反应物
微型台式离心机：用于沉淀反应物
电泳仪：用于TRAP分子电泳分离
平式摇荡仪：用于染色反应
染色塑料盒：用于PAGE凝胶染色的容器
自动成像仪或PHOSPHORIMAGE：用于电泳染色记录
实验步骤
样品制备
手术取出动物组织，并秤取100毫克待测组织
放进预冷的50毫升锥形离心管
加入3毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A）
小心移去清理液
移入到一个液氮冻存管
即刻放进液氮罐过夜
次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
放进DOUNCE 匀浆器
加入200微升预冷的YIJI裂解液（Reagent B）
匀化80下
小心转移到1.5毫升离心管
放进冰槽里孵育30分钟
即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
扩增反应
准备2个0.5毫升PCR管，置于冰槽里
按照下表依次加入反应物
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内容物 |
样品管 |
阴性对照管 |
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YIJI反应液（Reagent C） |
48微升 |
48微升 |
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组织裂解悬液样品 |
2微升（200纳克组织总蛋白） |
―― |
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YIJI裂解液（Reagent B） |
―― |
2微升 |
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总量 |
50微升 |
50微升 |
混匀
室温下（30℃）孵育30分钟
即刻放进PCR仪，按照下表扩增
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反应温度（℃） |
反应时间 |
反应循环 |
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94 |
90秒 |
1 |
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94 |
30秒 |
28
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|
60 |
30秒 |
分别加入5微升YIJI上样液（Reagent D）
置入冰槽里等待上样
垂直电泳分析
实验开始前，将YIJI胶底液（Reagent E）、YIJI凝结液（Reagent F）、YIJI促进液（Reagent G）和YIJI胶体液（Reagent H）放进37℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。
移出3毫升YIJI胶底液（Reagent E）到15毫升锥形离心管里
加入100微升YIJI凝结液（Reagent F）
加入10微升YIJI促进液（Reagent G）
混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
移出30毫升YIJI胶体液（Reagent H）到50毫升锥形离心管里
加入600微升YIJI凝结液（Reagent F）
加入60微升YIJI促进液（Reagent G）
混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
插入10孔梳
在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
移取50毫升YIJI电泳液（Reagent I）到500毫升容器里，加入450毫升无离子水，混匀后，标记为YIJI电泳工作液
加入适量的YIJI电泳工作液到电泳槽里
在4℃环境下预运行15分钟，电压为150伏
上样：25微升（注意：使用20碱基的DNA marker）
继续4℃环境下电泳2小时，电压为150伏，或直至溴酚蓝（Bromophenol Blue）染料移动到胶体三分之二处
拆除电泳装置，取出电泳玻璃板块（注意：胶体脆弱）
分离玻璃板快，切除胶底
将胶体放进染色塑料盒里
小心加入20毫升YIJI固定液A（Reagent J）到上述塑料盒里
小心加入80毫升YIJI固定液B（Reagent K），混匀
置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM
小心倒去固定液
小心加入80毫升用户自备的无离子水
小心加入20毫升YIJI染色液（Reagent L）
置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM，避免光照
小心倒去YIJI染色液（Reagent L）
小心加入100毫升用户自备的无离子水
置于平式震荡仪上，在室温下孵育1分钟，速度为50RPM
小心倒去无离子水
准备1个200毫升烧杯
加入80毫升用户自备的无离子水
加入20毫升YIJI中和液（Reagent M）
加入100微升YIJI显影液A（Reagent N）
加入100微升YIJI显影液B（Reagent O），混匀
小心倒入塑料盒里
置于平式震荡仪上，在室温下孵育6分钟，速度为50RPM（注意：可见金黄色条带；避免过度染色）
小心倒去显影液
小心加入80毫升用户自备的无离子水
小心加入20毫升YIJI终止液（Reagent P），混匀
置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM（注意：可以保存在终止液里）
小心取出胶体
即刻置于自动成像仪上或PHOSPHORIMAGE下成像记录，并测算条带强度
计算端粒酶活性：
染色处理
所有阶梯条带强度累加之和÷内参条带强度＝相对TRAP活性
注意事项
本产品为10次操作（包括10次裂解、20次反应、2次电泳）
整个操作过程，须戴手套
必须使用带滤芯的枪头
所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染
建议使用裂解液作为阴性对照
内参分子大小为36bp
内参条带信号过弱，表明端粒酶活性过高，建议稀释或减少样品量；建议实验操作增加样品浓度梯度
电泳前注意清洗样品孔
电泳操作注意安全
染色时，须在室温下操作，并避免光照；避免过度染色
染色时间可以根据情况调整（参考图像如下：黑色箭头指示内参条带36碱基；括号区域表明六碱基相间的阳性条带，起始条带为50碱基）
