方案5 蛋白质的胰酶消化实验
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.冻干的蛋白质底物溶解在 1% 的碳酸氢铵中，控制使用尽量少的溶液体积，以达到较高的底物浓度。 当蛋白质底物很微量（如小于 1mg) 时，加入 Tween-20 到碳酸氢铵中使其终浓度为 lg/L，否则底物（和酶）会吸附在管壁上，造成样品损失。碳酸氢铵是一种易挥发的缓冲溶液，通过冷冻干燥轻松去除。PH8 的不易挥发的缓冲溶液，例如 0.05 mol/L Tris-HCl （pH8.0~8.3）可以代替碳酸氢铵。 2.将胰酶加到底物中去。对于变性的蛋白质（比如还原或烷基化的蛋白质），底物与酶的比例为 200:1 到 50:1; 对于天然蛋白质，比例可以高达 1:1; 对于凝胶中的蛋白质消化，不管底物的量是多少，用0.5~1.Oug 的胰酶（一般而言，对于考马斯亮蓝染色的蛋白质用量小于0.5ug)。 3.设无蛋白质样品的对照反应混合物（如果样品充足，可设不加胰酶的第二份反应液），作为 RP-HPLC 肽段作图的对照。 4.反应液置于 37°C 保持 16 h(也可过夜) 5.把样品转移到 RP-HPLC 层析柱上以停止反应，并开始肽谱分析，或把反应液放到冰上以减慢反应。 或者加入特异性的抑制剂以终止反应。抑制剂如 N-α-甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（N-α-tosyl-L-lysyl chloromethyl ketone)，或 N-甲苯磺酰-L-丙氨酰氣甲酮（N-tosyl-L-pHenylalanine chloromethyl ketone;TPCK)，或 PMSF，加人量要多于所用的胰酶量。因为胰酶在低 pH 值的情况下活性不高，也可以通过调节反应混合物的 pH 值为 2~3 来终止反应（比如加人易挥发的乙酸或三氟乙酸）。 |
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