脊索瘤相关基因鉴定及筛查实验
mRNA差异显示法
| 实验方法原理 | 真核生物的mRNA 5’端有个帽子结构，3‘端有长约200 bp 的poly(A)尾巴。据此特点，可设计一种与其互补的序列oligo dT，为了把它锚定在poly（A）尾的起始端，将其设计成T12MN（M=A/C/G；N=A/T/C/G），这样T12MN 就有12 种不同的组合。将T12MN 作为反转录引物，就可以将带有poly（A）尾的mRNA 反转录为相应的cDNA，再用该引物锚定cDNA第二链的3′端，此时引入一随机引物进行PCR 扩增，由于随机引物随机结合在cDNA 的互补靶位点上，源于不同mRNA的扩增片段其大小不同，因此经过PCR 扩增的产物其大小也不同，通过电泳等技术显示在凝胶上，就可以检测到有差异的cDNA片段。经过验证其确实为特异片段，进而筛选cDNA文库或运用cDNA 末端的快速扩增（ Rapid Amplification of cDNA End，RACE）技术获得全长cDNA。 |
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| 实验材料 | 18例脊索瘤及其周围正常组织(距肿瘤5cm以上)标本 |
| 试剂、试剂盒 | 琼脂糖 TBE电泳缓冲液 电泳载样缓冲液 溴化乙锭(EB)溶液母液 DNAGreen Trizol试剂 |
| 仪器、耗材 | PCR仪 离心管 移液枪 枪头 枪头盒 水浴锅 自动凝胶电泳成像分析仪 |
| 实验步骤 |
一、 材料准备 1. 标本 18例脊索瘤及其周围正常组织(距肿瘤5 cm以上)标本来自中国医科大学附属第一、二医院、辽宁省人民医院、沈阳市中心医院骨科，经病理切片确诊为脊索瘤，取材后立即置于液氮中速冻，然后贮存于-7O℃冰箱中备用。本研究中mRNA-DD试 验所用标本编号为15，采自中国医科大学附属第一医院(2000-10-20)，60岁男性患者， 病理号为328874。 2. 引物 锚定引物(Anchored primer，HIEROGLYPH)： T7(dT12)AP8 5 ACGACTCACTATAGGGCrITITTrrrrrIT丌AA3 T7(dT12)AP11 5 ACGACTCACTATAGGGCTT1Tn T 几TIrrAT3 随机引物(Arbitrary primer，HIEROGLYPH)： M13r-ARP1： 5 ACAArITITCACACAGGACGACTCCAAG3 M 3r-ARP2：5 ACAArITITCACACAGGAGCTAGCATGG3 M13r-ARP3：5 ACAArITITCACACAGGAGACCATrGCA3 M13r-ARP4：5 ACAArITITCACACAGGAGATAGCAGAC3 二、 总RNA提取 应用Trizol试剂(GIBCOBRL)提取总RNA。 三、 反转录 取1 ug总RNA，应用GIBCOBRL的反转录试剂盒进行反转录，PCR反应体系20 ul，引物为1_7(dT12)APs，条件见试剂盒。 四、DD-PCR扩增 引物为M13r-ARPs，体系为10 ul，PCR扩增条件为：95℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 2 min，5个循环：95℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，31个循环。 五、产物检测 取3 ul产物进行8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(50℃ ，3000 V，100 W，4～5 h)，GenomyxLRTM Fluores-cent Imaging Scanner扫描。然后将差异条带切下。
六、差异cDNA片段的纯化、测序、同源性比较与分析
差异条带重新进行PCR扩增， 扩增条件同DD-PCR，体系10.0 ul。将纯化的cDNA片段进行测序(上海生工生物工程技术公司)，测序结果在互联网上进行同源性比较和分析。 七、 差异cDNA片段的验证 根据两个差异cDNA片段的测序结果，分别设计一对特异引物(扩增507 bp和448 bp两个片段)，以相同脊索瘤患者的总RNA为模板，进行RT-PCR反应。两对特异引物的复性温度分别为58℃(cDNA1)和60℃(cDNA2)，引物序列如下： cDNA 1：TCTGCCACATCTrGGCCrITITCAACCTCTGCTFCCCAGGCT cDNA2：AACAGCCCTCAGCATrGGCTATGCCCAGATGGAGCCTCTC 内对照所用B-actin(318 bp)引物序列如下： MW 5，ATCATGrITITGAGACCTCCAACA3 MW 5 CATCTCTFGCTCGAAGTCCA3 PCR反应条件：94℃ 30 s，58℃～60℃ 30 s，72℃1.5 min，35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳， 条件为80 V，60～90 min，自动凝胶电泳成像分析仪分析结果。
八、 差异cDNA片段与脊索瘤相关性的筛查 按照差异cDNA片段的验证实验所用方法，对剩余17例脊索瘤及其周围正常组织进行cDNA1和cDNA2两个差异片段的RT-PCR筛查。
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| 注意事项 |
第二代是限制性酶切片段差异显示技术，也就是所谓的RFDD-PCR。限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是对相对应liangpeng发明的传统ddrtpcr的很有效的改进。RFDD-PCR不是直接扩增cDNA，而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。
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| 其他 |
Sokolov等首次用琼脂糖凝胶电泳，EB呈色替代聚丙烯酰胺电泳和射自显影，使得工作大大简化。崔凯荣等对该方法加以改进，利用DD-PCR成功地得到3个在枸杞体细胞胚发生早期组织中基因特异表达的片段。
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