采用CORTECS UPLC HILIC色谱柱开发ACh、HA及其代谢产物...（二）
UPLC分离
ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA是以相对较低浓度存在的强极性小分子化合物，这使其难以通过常规的反相色谱进行检测。此外，由于共流出的相关分子(如盐类或其它低分子量内源性组分)的基质诱导干扰和离子抑制作用，导致对生物基质中的这些内源性分析物进行定量分析常常较为困难9。
在本应用纪要中，我们利用亚2µmCORTECS UPLC HILIC色谱柱和ACQUITY UPLC系统实现了ACh、HA及其各自代谢产物的色谱分离。确定最适宜的甲酸铵浓度(流动相A)为100mM(pH3)，流动相B由乙腈组成。在最佳流速为0.5mL/min、梯度为30%-90%B时，其在45℃的柱温下分析循环时间为2.5min。
流动相添加剂的浓度对方法特异性、灵敏度以及将目标分析物与流动相和内源性基质进行色谱分离的能力具有重要影响。较高的缓冲液浓度100mM(而不是20至50mM)极大地改善了后洗脱分析物的峰宽。特别是高mM浓度的甲酸铵使t-MIAA的峰拖尾现象显著减少。定量下限控制标准品(LLQC)中的ACh、Ch及其各自代谢产物，色谱保留时间和性能如图2所示。ACh、Ch及其各自代谢产物和ACh的同分异构体Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基铵在1.35至1.75min内洗脱，基线峰宽小于3.7s。
由于Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基铵在脑中以较高浓度存在，因此本研究对其进行了分析。据报道，它是肉毒碱生物合成中的酶(G-甜菜碱羟化酶)的底物11。ACh和Iso-ACh为同分异构体，在进行CSF中ACh的准确定量时确保二者的色谱分离度相当重要。在人CSF样品提取物中(图3)，突显了存在的高浓度内源性Iso-ACh。将ACh以1000pg/mL的浓度加标至人CSF中，以展示ACh和Iso-ACh之间的色谱分离和浓度差异。
样品制备
选择人工CSF(aCSF)作为替代基质用于制备标准曲线，以对所有分析物进行定量。aCSF较容易获得，且花费不像人CSF那样高昂，因此，将其作为替代基质更为实际。为了确保aCSF可作为合适的基质用于所有分析物的准确定量，我们制备了ACh、HA和t-mHA的加标人CSFQC样品，以及Ch和t-MIAA的aCSFQC样品。Ch和t-MIAA的QC样品由aCSF配制，是因为人CSF中内源性基底水平的ng/mL浓度较高，使得难以通过标准品加入法在适用于其它分析物测定的线性范围内进行定量，因此需使用aCSF制备Ch和t-MIAA的QC样品。此外，人CSF中Ch的ng/mL浓度较高，因此需要采用aCSF对样品进行稀释以便在动态检测范围内进行准确定量。
如Zhang、Tingley、Tseng等人所述，所有人CSFQC样品和人CSF样品均含有最终浓度为4mM的稳定剂毒扁豆碱，用于阻止ACh经酶转化为Ch和醋酸盐。标准曲线、人CSFQC样品、aCSFQC样品和样品均采用1mL96孔板制备。通过加入含实验部分所述内标的乙腈，进行一步法样品稀释(样品量：乙腈量1：5)。使用96孔板可以在15min内完成样品制备，满足了开发定量分析方法所需的高通量分析要求。
线性、精度和准确度
使用ACh、HA、t-mHA和t-MIAA的氘代稳定同位素标记标准品(ISTD)进行定量分析。用d4ACh内标进行Ch定量。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的标准曲线(1/x加权)在定量动态范围内呈线性(>0.99)。各分析物的动态范围、线性、平均QC准确度和定量下限(LLOQ)如表2所示。ACh的代表性校准曲线示于图4中。
以人CSF和aCSF的混合物为基质制备QC样品，用于评估样品内精度和重现性。通过分析未加标的人CSF，测定ACh、HA和t-mHA的基底水平。通过从CSF源中扣除平均基底水平浓度得出相应的QC水平，从而测得QC浓度。ACh、HA和t-mHA的加标人CSFQC样品分析，以及Ch和t-MIAA的加标aCSFQC样品分析的代表性结果如表3和4所示。aCSF和人CSF校准定量完成后，利用aCSF标准曲线测定人CSF中各分析物的内源性基底浓度。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的基底水平平均测定值汇总于表5中。准确度和精度值符合FDA关于LC/MS/MS检测的法规标准12,13。
结论
■ 这种快速、简单、灵敏且高选择性的UPLC分析方法能够对人CSF中的ACh、HA及其各自代谢产物进行分离和同时定量。
■ 使用96孔板可以在15min内完成样品制备，提供了研发 阶段分析方法所需的高分析通量。
■ CORTECS UPLC HILIC色谱柱的分离度和灵敏度改善了内源性基质组分的分离和分离度，所用分析时间仅2.5min。
■ Xevo TQ-SMS的高灵敏度使得只需少量样品(20µL)和5倍的稀释，即可达到低至10pg/mL的检测限，并具有宽的定量动态范围10-30000pg/mL。
■ 所有分析物的QC样品分析结果均符合FDA法规标准，变异系数为0.3%-10.1%，准确度范围94.7%-113.7%，表明本方法的重现性和准确度良好。
■本文所介绍的方法展示出在药物开发的研发阶段对多种神经性生物标记物进行高选择性和高灵敏度定量的潜力。
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